miRNA-323對胃癌細胞增殖作用的研究

陳 鶴，盧 楊，趙 燕，余焱霞，王中新，張 敏

胃癌是常見的惡性腫瘤，雖然發病率的逐年降低，但是臨床治療中仍然存在各種各樣的困難。隨著微小RNA(microRNA, miRNA)的研究[1-2]越來越多，顯示其與胃癌的發病有著密切的關系，包括調控細胞增殖、凋亡和代謝等。Link et al[3]研究報道了miRNAs能夠作為胃癌診斷的一種方式。Guoping et al[4]的研究也證明miRNA143上調可以抑制胃癌細胞增殖，而下調miRNA143可促進胃癌細胞增殖。由此可見，miRNA與胃癌有著密不可分的關系，但是這些miRNAs在胃癌中分別具有哪些作用還不明確。

miRNA是一類大小為18～25個核苷酸非編碼單鏈RNA分子，通過與下游mRNA的3′端UTR配對進而抑制mRNA的翻譯。Yang et al[5]研究發現miRNA-323過表達靶向抑制BRI3誘導大鼠海馬神經元凋亡。Yang et al[6]還發現miRNA-323-5p能夠靶向結合IGF-1R，抑制人腦膠質瘤U373細胞的生長和增殖，促進細胞凋亡。但是miRNA-323在胃癌中的作用還不清楚。該研究主要通過細胞轉染等技術研究miRNA-323對胃癌細胞SGC7901增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料培養細胞用胎牛血清購自美國Cyagen公司；高糖DMEM購自美國Hyclone公司；轉染用Opti-MEM購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000 Reagent購自美國Invitrogen公司；提取RNA的TRIzol購自美國Invitrogen公司；提取總蛋白用的RIPA裂解液、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠抗β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和C-myc抗體購自美國Cell signaling公司；miRNA-323 inhibitor和miRNA-323 mimic購自美國Biomics公司；qRT-PCR分析儀器購自美國伯樂公司。

1.2 樣本收集與細胞培養選取臨床中6例胃癌患者，年齡33～78(61±4.8)歲，手術后分別選取胃癌和癌旁組織，生理鹽水清洗后保存于-80 ℃，且患者簽署知情同意書。人胃癌細胞株SGC7901復蘇后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液、置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.3 細胞轉染取對數生長期細胞進行細胞轉染, 按Lipofectamine 2000轉染說明書的方法將miRNA-323 inhibitor和miRNA-323 mimics分別轉染到SGC7901細胞中。細胞轉染24 h后提取細胞總RNA進行實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)檢測轉染后細胞中miRNA-323的表達變化，細胞轉染48 h后，提取細胞總蛋白進Western blot法檢測。miRNA-323 mimic引物序列：F：5′-CACAUUACACGGUCGACCUCU-3′，R：5′-AGGUCGACCGUGUAAUGUGUU-3′，miRNA-323 inhibitor 引物序列：5′-AGAGGUCGACCGUGUAAUGUG-3′。

1.4 qRT-PCR檢測細胞中miRNA-323的表達收集組織或處理后的SGC7901細胞，并用TRIzol試劑提取細胞總RNA。根據說明書使用EzOmics One-Step qRT-PCR Kit (美國Biomics公司)進行qRT-PCR檢測。

1.5 Western blot法檢測細胞中Cyclin D1和C-myc蛋白表達的改變收集轉染后48 h的細胞，PBS洗滌2次；加 100 μl細胞裂解液于冰床上慢敷30 min后，將細胞刮盡，吸入到1.5 ml離心管中，12 000 r/min離心30 min，取上清液，向其中加入上清液1/4體積的離心后的SDS-蛋白上樣緩沖液，于100 ℃水浴鍋中加熱10 min，取出后置于-20 ℃冰箱保存。加樣后，80 V電泳30 min，然后換電壓，120 V電泳60 min。將蛋白質電轉移至PVDF膜上，用牛奶于室溫封閉3 h后, 分別加入 1 ∶500稀釋的Cyclin D1和C-myc兔抗人多克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體，于4 ℃孵育過夜；洗膜后分別加入1 ∶10 000稀釋的山羊抗兔IgG(用于檢測Cyclin D1和C-myc)和山羊抗鼠IgG(用于檢測β-actin), 于室溫下敷育1 h后，充分洗膜，將膜放入Odyssey雙色紅外激光成像系統直接進行掃描成像。計算各條帶的積分光密度值，比較分析。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期細胞轉染48 h后，用胰酶消化后，收集單細胞懸液，用冷PBS洗2次。在15 ml離心管中用500 μl PBS重懸細胞，向其中緩慢加入3 ml預冷的70%乙醇，4 ℃冰箱中過夜。取5×106細胞，在15 ml離心管中離心10 min，棄上清液，收集細胞，用冷PBS洗2次。用500 μl PBS重懸細胞。加入RNaseA溶液5 μl，37 ℃水浴30 min。離心10 min，棄上清液，收集細胞，加入400 μl PI染液重懸細胞，輕輕混勻后4 ℃避光孵育45 min后上機檢測。

2 結果

2.1 miRNA-323在胃癌組織中的表達提取了胃癌組織和癌旁組織總RNA，并通過qRT-PCR檢測miRNA-323的表達情況。結果顯示，與癌旁組織比較，胃癌中miRNA-323顯著高于癌旁組織，且差異有統計學意義(t=63.618，P<0.01)，見圖1。

2.2 抑制miRNA-323表達對胃癌細胞SGC-7901增殖的影響為了研究miRNA-323對胃癌細胞增殖的影響，本實驗選用了胃癌細胞株SGC-7901作為研究對象。首先使用miRNA-323 inhibitor抑制miRNA-323表達，觀察miRNA-323對胃癌細胞SGC-7901增殖的作用。qRT-PCR結果顯示，miRNA-323 inhibitor能夠顯著下調miRNA-323的表達(F=11.72，P<0.01)。如圖2所示，給予miRNA-323 inhibitor后，SGC-7901細胞中癌基因C-myc和Cyclin D1表達顯著降低，且差異有統計學意義(F=15.88，P<0.05；F=9.01，P<0.01)。同時，流式細胞儀檢測SGC-7901細胞周期結果顯示，miRNA-323 inhibitor組細胞S期比例(20.7±3.1)%明顯低于對照組S期比例(34.6±4.3)%。由此，抑制miRNA-323表達可以抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖。

圖1 miRNA-323在胃癌組織中的表達

1：癌旁組織 2：胃癌組織；與胃癌組織比較：**P<0.01

2.3 增加miRNA-323表達對胃癌細胞SGC-7901增殖的影響將miRNA-323 mimic轉染進SGC-7901細胞增加miRNA-323表達，觀察miRNA-323對胃癌細胞SGC-7901增殖的作用。由圖3A所示，miRNA-323 mimic能夠顯著提高miRNA-323的表達(F=13.38，P<0.01)。給予miRNA-323 mimic后，Western blot結果顯示C-myc和Cyclin D1表達明顯升高，且差異有統計學意義(F=13.81，P<0.01；F=11.99，P<0.01)。同時，細胞流式儀檢測SGC-7901細胞周期顯示，miRNA-323 mimic組細胞S期比例(52.7±6.3)%明顯低于對照組S期比例(33.6±4.1)%。由此表明，增加miRNA-323表達可以促進胃癌細胞SGC-7901的增殖。見圖3。

圖2 抑制miRNA-323表達對胃癌細胞SGC-7901增殖的影響

A：qRT-PCR檢測miRNA-323 inhibitor處理后SGC-7901細胞中miRNA-323表達量；B：Western blot檢測miRNA-323 inhibitor處理后SGC-7901細胞中C-myc和Cyclin D1的蛋白表達量；C：流式細胞儀檢測miRNA-323 inhibitor處理后SGC-7901的細胞周期；1：對照組；2：miRNA-323 inhibitor組；與對照組比較：#P<0.05,##P<0.01

3 討論

胃癌的病因多種多樣，目前仍未有徹底治愈胃癌的治療手段，并且關于胃癌的致病機制也尚未研究至清。但是已經有大量文獻證明miRNAs在胃癌治療中發揮著積極作用，如彭偉輝 等[7]發現miRNA-145能夠通過調控C-myc表達抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖與侵襲；miRNA-101與胃癌細胞SGC-7901和MKN45細胞的增殖、遷移、侵襲能力有著密切的關系[8]。而本研究也顯示，抑制miRNA-323表達也同樣能夠抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖。

miRNAs為非編碼蛋白RNA，能夠通過調控靶基因來影響生長、發育。本研究顯示， miRNA-323表達可以影響細胞周期蛋白Cyclin D1和癌基因C-myc表達。Cyclin D1和C-myc已經被證明參與細胞的增殖，能夠反映細胞增殖情況[7]。通過Western blot檢測使用miRNA-323 inhibitor抑制miRNA-323表達后，Cyclin D1和C-myc的蛋白表達顯著下調。同時，miRNA-323 mimic增加miRNA-323表達后，Cyclin D1和C-myc的蛋白表達明顯上調。說明miRNA-323可能會影響細胞增殖。為了進一步確認并觀察miRNA-323對細胞增殖的作用，本實驗分析細胞周期情況，結果顯示miRNA-323 inhibitor將細胞阻滯在了S期，抑制了細胞的有絲分裂，從而阻滯了細胞增殖。這進一步說明了miRNA-323的表達可以影響細胞增殖。

綜上，本研究探討了miRNA-323對胃癌細胞增殖的作用，結果顯示抑制miRNA-323表達可以抑制胃癌細胞的增殖。Yang et al[6]發現miRNA-323可以通過靶向結合IGF-1的表達抑制膠質瘤的增殖，由此，miRNA-323影響胃癌細胞的增殖可能也是通過靶向結合IGF-1的表達引起的。這說明miRNA-323可以作為治療胃癌的一個靶點，但其具體機制，尚未研究清楚，還需要進一步的研究加以佐證。

圖3 增加miRNA-323表達對胃癌細胞SGC-7901增殖的影響

A：qRT-PCR檢測miRNA-323 mimic處理后SGC-7901細胞中miRNA-323表達量；B：Western blot檢測miRNA-323 mimic處理后SGC-7901細胞中C-myc和Cyclin D1的蛋白表達量；C：流式細胞儀檢測miRNA-323 mimic處理后SGC-7901的細胞周期；1：對照組 2：miRNA-323 mimic組；與對照組比較：##P<0.01