小型豬二尖瓣反流致心力衰竭模型構建及心肌硫化氫體系變化的研究

劉尚雨，鄭黎暉，李波，李巨波，唐躍，姚焰

二尖瓣反流是臨床常見的心臟瓣膜疾病之一，血液在心室收縮期從左心室通過二尖瓣口反流至左心房，造成左心房負荷和左心室舒張期負荷加重，引起左心房、左心室擴大，臨床上出現肺淤血和體循環灌注低下等左心衰竭表現。左心室負荷增加會促進心肌纖維化，導致左心室順應性降低而加重心力衰竭的進展和靶器官損傷[1]。硫化氫（H2S）是繼一氧化氮、一氧化碳后發現的第三種內源性氣體信號分子，調節機體的多種生理學功能[2-4]。在心肌缺血模型中心肌H2S 的合成體系下調，補充H2S 可保護心肌的缺血性損傷，而阻斷H2S 生成會加重損傷[5-6]。壓力負荷增加所致的左心功能下降是臨床常見的心力衰竭類型，但因動物模型制作困難，目前對其病理生理機制研究較少。本研究旨在采用大動物水平通過小切口非體外循環下二尖瓣腱索拉傷構建小型豬二尖瓣反流慢性心力衰竭模型，檢測心臟功能和結構改變，并探究H2S 體系在慢性心力衰竭中的變化，為臨床對于壓力負荷增加所致慢性心力衰竭病理生理機制和H2S 體系在心力衰竭中的作用提供進一步認識。

1 材料與方法

1.1 模型制備

研究選用健康8 個月齡中華小型豬，術前體重約30 kg，由中國醫學科學院阜外醫院實驗動物中心飼養并提供，隨機分為二尖瓣反流組（n=6）、對照組（n=6）。采用前期探索的小切口非體外循環下二尖瓣腱索拉傷造成二尖瓣反流建立慢性心力衰竭動物模型[7-8]。動物采用氯胺酮和地西泮誘導麻醉，氣管插管，術中采用異氟醚維持麻醉。于左側第3 或第4 肋間隙行約4 cm 平行肋間小切口，暴露心包，于左心室側壁近心尖處縫合荷包，置入自制的“瓣膜損傷器”，回勾住二尖瓣后葉腱索并拉斷，采用心表超聲通過心尖二腔心切面驗證二尖瓣后瓣脫垂造成中至大量反流，退出損傷器后縮窄荷包。對照組動物僅進行開胸及縫合荷包操作，不損傷二尖瓣。所有動物術后一周給予青霉素3 萬單位/d 抗感染，常規飼養6 個月。

1.2 超聲心動圖評價

動物采用氯胺酮和地西泮誘導麻醉，氣管插管，固定于檢查臺，超聲心動圖采用GE 公司的Vivid7 型彩色多普勒超聲心動儀，采集左心房前后徑（LAD）、左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室射血分數（LVEF）、左心室縮短分數（LVFS）等指標。LVEF 測定采用Simpson 雙平面法。二尖瓣反流程度采用反流束面積/左心房面積比值計算，按照臨床常規定義比值小于20%為輕度反流、20%～40%為中度反流、大于40%為重度反流。

1.3 在體心功能學評價

動物如1.1 所述方法麻醉，記錄肢體導聯心電圖，穿刺右側股動脈置入導絲，交換為8F 鞘管測量動脈壓力，通過鞘管置入5F 豬尾導管至左心室測量左心室壓力。心電與壓力換能器與多導生理記錄儀相連，穩定后連續記錄至少15 min 生理參數。采用儀器分析軟件分析壓力參數，動脈壓分析：平均動脈壓、收縮壓、舒張壓；左心室內壓分析：左心室收縮末期壓力（LVSP）、左心室舒張期最低壓（LVDP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）、左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）等。實驗結束后動物安樂死，提取左心室組織分別中性福爾馬林固定和液氮速凍-80℃保存。

1.4 術后6 個月H2S 和N 末端B 型利鈉肽原（NTproBNP）含量檢測

采用化學比色法檢測H2S 含量，依據文獻[9]描述方法，將0.1 ml 血漿加入含有0.167%醋酸鋅3.0 ml測試管中，加入0.5 ml 7.2 mol/L 鹽酸配制的對苯二胺鹽酸鹽溶液，再加入0.4 ml 1.2 mol/L 鹽酸配制的三氯化鐵溶液，室溫反應20 min 后加入1 ml 10%三氯乙酸，離心取上清于分光光度計檢測665 nm 波長下吸光度。H2S 標準曲線采用10 mmol/L 硫氫化鈉溶液梯度稀釋制作。

采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測NTproBNP 含量，血清樣本使用雙抗夾心法NT-proBNP ELISA 檢測試劑盒（R&D 公司，美國），嚴格按照說明書操作，酶標儀度數。

1.5 術后6 個月心臟重構和H2S 體系相關蛋白和基因表達檢測

采用Western blot 法檢測左心室心肌組織心臟重構相關蛋白Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ），H2S 合成體系胱硫醚-β-合成酶（CBS）；胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）蛋白含量。采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （GAPDH） 作為內部參照，采用灰度值比比較蛋白的含量差異；心肌組織經Trizol 法提取RNA，反轉錄為cDNA 文庫。采用實時定量 PCR 法檢測心臟重構相關Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及H2S 合成體系CBS、CSE mRNA 表達含量。采用GAPDH 作為內部參照，采用比值法比較基因表達的差異。

1.6 統計學分析

采用SPSS 19.0 統計分析軟件。計量資料采用均數±標準差表示，比較采用獨立樣本t 檢驗，超聲心動圖指標采用配對樣本t 檢驗。雙側P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

對照組與二尖瓣反流組超聲心動圖指標（表1）：兩組動物均在術前和術后6 個月行超聲心動圖檢測，二尖瓣反流組采用反流束面積/左心房面積比值評價均為二尖瓣大量反流（57.85±7.09）%。二尖瓣反流組術后6 個月LAD 與對照組比較明顯擴大[（4.73±0.28）cm vs （2.67±0.12）cm，P＜0.01]，LVESV[（18.50±2.88） ml vs（10.50±0.99）ml，P ＜0.05] 和 LVEDV[（87.50±12.12） ml vs （42.33±2.04 ） ml，P＜0.01] 明 顯 增 加， 但LVEF[（78.67±1.87）% vs （75.33±1.87）%，P＞0.05]和LVFS[（52.50±1.73）% vs （46.67±2.86）%，P＞0.05]無明顯變化。

表1 對照組與二尖瓣反流組超聲心動圖指標（±s）

二尖瓣反流組與對照組術后6 個月血流動力學指標與血流動力學左心室壓力-時間曲線（表2、圖1）：取材前經血流動力學檢測，二尖瓣反流組與對照組比較，股動脈平均壓[（83.79±3.81） mmHg vs（88.40±3.48） mmHg，P＜0.01]明顯降低；動脈收 縮 壓[（69.84±4.41） mmHg vs （108.70±3.82）mmHg，P＜0.01]和舒張壓[（54.63±2.44） mmHg vs（69.73±2.37） mmHg，P＜0.05]也明顯降低；左心室功能LVSP[（86.66±5.60） mmHg vs （117.70±5.49）mmHg，P＜0.01] 明 顯 降 低； LVDP[（-0.30±1.03）mmHg vs （-6.81±0.43） mmHg，P＜0.01] 明顯升高；LVEDP [（12.93±2.43） mmHg vs （12.14±0.66）mmHg，P＞0.05] 兩組間差異無統計學意義。左心室壓力下降速率[（2 427.90±219.20） mmHg/s vs（3 562.72±233.02） mmHg/s，P＜0.01] 和 下 降 速 率[（-2 543.73±164.40） mmHg/s vs （-3 464.82±206.30）mmHg/s，P＜0.01]明顯鈍化。左心室壓力-時間曲線可見：對照組左心室收縮期和舒張期壓力變化迅速、波形銳利，收縮平臺期較短且壓力可維持在較高水平；二尖瓣反流組動物左心室收縮期和舒張期壓力變化緩慢、波形粗頓，收縮期峰壓力不能有效維持，反流造成壓力波形震顫。

表2 對照組與二尖瓣反流組術后6 個月血流動力學指標比較（

表2 對照組與二尖瓣反流組術后6 個月血流動力學指標比較（

注：+dp/dtmax：左心室內壓正向最大變化速率；-dp/dtmax：左心室內壓負向最大變化速率。1 mmHg=0.133 kPa

平均動脈壓 (mmHg) 88.40± 3.48 83.79±3.81 0.008動脈收縮壓 (mmHg) 108.70±3.82 69.84±4.41 0.001動脈舒張壓 (mmHg) 69.73±2.37 54.63±2.44 0.013左心室收縮末期壓力(mmHg) 117.70±5.49 86.66±5.60 ＜0.001左心室舒張末期壓力(mmHg) 12.14±0.66 12.93±2.43 0.762左心室舒張期最低壓(mmHg) -6.81±0.43 -0.30±1.03 0.002+dp/dtmax (mmHg/s) 3 562.72±233.02 2 427.90±219.20 0.005-dp/dtmax (mmHg/s) -3 464.82±206.30 -2 543.73±164.40 0.006

圖1 對照組與二尖瓣反流組術后6 個月血流動力學左心室壓力-時間曲線

術后6 個月兩組動物心臟形態、病理學變化：心臟取材后經心尖-二尖瓣-左心房縱向剖開大體觀察，二尖瓣反流組動物二尖瓣后瓣腱索斷裂，瓣葉卷曲增厚，邊緣不規則增生，左心室心腔明顯擴大，游離壁心肌增厚。左心室組織經5 μm 厚度石蠟切片蘇木素-伊紅（HE）染色顯微鏡觀察：對照組心肌纖維排列整齊，細胞核大小形態均勻，肌束間存在少量間質；二尖瓣反流組心肌纖維排列明顯紊亂，心肌細胞肥大，部分輕度空泡樣變性或肌溶解，細胞核大小不等，心肌間質明顯增多部分區有纖維條索，間質中有炎性細胞浸潤。經馬松（Masson）染色顯示，二尖瓣反流組膠原等結締組織被染成藍色、心肌組織被染成粉紅色。經顯微鏡觀察：二尖瓣反流組心肌間質膠原明顯增多，結締組織相互連接成條索樣分布，部分區域有瘢痕形成（圖2）。

二尖瓣反流組與對照組術后6 個月H2S 和NTproBNP 變化（圖3）:二尖瓣反流組與對照組比較，血漿H2S水平明顯降低[ （27.48±2.78） μmol/L vs （37.87±3.55）μmol/L，P=0.044]，血清NT-proBNP 水平明顯升高[（2 132.00±212.30）μg/L vs （456.70±40.79）μg/L，P＜0.001]。

術后6 個月兩組動物心臟重構和H2S 合成體系相關蛋白和基因表達變化（圖4、圖5）：左心室心肌組織經Western blot 檢測蛋白表達，二尖瓣反流組與對照組比較，與心肌重構相關的Collagen I（1.495±0.106 vs 1.023±0.067，P=0.003）、CollagenⅢ （1.413±0.042 vs 1.010±0.086，P=0.002 ）表 達明顯上調； H2S 合成相關的酶CSE（0.750±0.030 vs 1.012±0.018，P=0.001） 與CBS（0.676±0.123 vs 0.998±0.030，P=0.029 ）表達明顯下調。左心室組織制備的cDNA 文庫采用Real-time PCR 法檢測基因表達，二尖瓣反流組與對照組比較，心臟重構相關Collagen Ⅰ（1.658±0.134 vs 0.995±0.076，P=0.002）、Collagen Ⅲ（1.805±0.120 vs 1.037±0.090，P=0.001 ） mRNA 表達含量明顯升高，H2S 合成體系CSE （0.690±0.064 vs 1.038±0.053，P＜0.001 ）、CBS（0.772±0.025 vs 1.003±0.019，P=0.002）mRNA 表達含量明顯降低。

圖2 術后6 個月兩組動物左心室心肌病理學變化

圖3 兩組術后6 個月血漿H2S 與NT-proBNP 水平變化（n=6）

圖4 兩組術后6 個月心臟重構與H2S 合成體系蛋白變化比較（n=6）

圖5 兩組術后6 個月心臟重構與H2S 合成體系mRNA 表達水平比較（n=6）

3 討論

在本研究中，使用小型豬小切口非體外循環下二尖瓣腱索拉傷造成二尖瓣反流建立慢性心力衰竭模型，通過超聲心動圖和在體血流動力學評價發現二尖瓣反流組動物左心室擴張、泵功能下降，病理學評價所見二尖瓣反流組動物左心室發生明顯結構重構，通過分子生物學手段檢測二尖瓣反流動物模型循環H2S 水平和心肌H2S 合成酶明顯降低。研究提示H2S 合成體系下調可能參與二尖瓣反流所致心肌重構和心力衰竭的發展過程。

對于慢性心力衰竭的研究，多集中在冠狀動脈結扎形成的缺血性心力衰竭或腎素-血管緊張素系統過度激活形成的心肌重構等模型研究[10]。對于臨床中常見的壓力負荷增加性慢性心力衰竭的模型復制，大動物水平能夠更真實地反映心血管血流動力學變化，具有重要的價值。我們在前期大動物二尖瓣腱索拉傷模型的基礎上進行改良[7-8]，采用自制的“瓣膜損傷器”，經心尖入路拉斷二尖瓣后葉腱索以形成穩定的二尖瓣反流，持續6 個月后血清NT-proBNP 含量顯著增高，經病理學和分子生物學評價左心室已發生明顯重構，表現為心肌細胞的損傷和間質膠原的增生。本研究中二尖瓣反流組動物經心臟超聲心動圖檢測LVEF 和LVFS 未出現明顯減低，分析可能由于二維超聲相關參數計算的方法學在二尖瓣大量反流干擾下會出現偏差并不能客觀反映心室收縮功能[11]，經在體功能學實驗證實二尖瓣反流組動物左心泵功能嚴重受損，提示在臨床診斷中對于二尖瓣反流患者不能僅憑借超聲心室收縮參數正常而輕視病情的發展。

Abe 等[12]發現，H2S 可以在哺乳動物體內內源性產生，隨著研究的深入，發現H2S 可參與機體的多種生理功能的調節如：介導血管平滑肌舒張、降低血壓、保護心肌缺血再灌注損傷、保護阿霉素對心肌的毒性作用、抑制炎性反應等，被視為第三種氣體信號分子。H2S 可以在組織內源性生成，調控合成的酶主要為CBS、CSE 兩種關鍵酶[4]，這兩種酶的分布具有組織特異性，在心血管系統主要由CSE 發揮主要調節作用，近期發現在中樞系統存在3 -巰基丙酮酸硫轉移酶（3-MST）也可生成H2S，但具體調控作用還有待研究[13]。H2S 通過抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡、促進血管新生等作用維持心血管系統內環境穩態[14]。在心肌缺血、血管緊張素Ⅱ介導的高血壓模型中H2S 水平下調，如外源性給予H2S 供體可抑制疾病的病理生理學進展、保護靶器官的損傷[9，15]。

本研究發現，二尖瓣反流形成的慢性心力衰竭模型心肌損傷與重構，可能由于H2S 合成體系下降不能發揮相應的保護作用。有研究發現，給予H2S合成的抑制劑炔丙基甘氨酸（PPG）可觀察到動脈血壓升高[16]，在心肌缺血模型中阻斷H2S 合成可加重心肌損傷，外源性應用硫氫化鈉作為供體補充H2S可減輕心肌細胞氧化應激損傷。在由于二尖瓣反流形成的慢性心力衰竭過程中，H2S 體系的下調使心肌的自我保護功能作用下降，形成病理性損傷，導致功能學和形態學發生重構。由于H2S 的還原性可清除細胞應激所產生的活性氧和自由基[7，17]，可作為保護心肌損傷的治療靶點。

本研究發現，二尖瓣反流慢性心力衰竭動物模型H2S 合成體系下調，可能參與心肌重構和心力衰竭的發展。由于本實驗采用大型動物、模型制備困難，前期研究未設置H2S 補充治療實驗組，目前基礎中最常采用的H2S 供體硫氫化鈉半衰期短，毒性較大且不能口服給藥，研制新型藥物載體有助于將H2S 作為治療手段應用于臨床研究。