調(diào)胃承氣湯灌胃與灌腸對(duì)腸源性膿毒癥大鼠腸上皮細(xì)胞occludin和ZO-1蛋白表達(dá)的影響

趙鋒利， 吳思慧， 趙馥， 羅苑苑， 徐運(yùn)升， 冼紹祥

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

腸源性膿毒癥（gut-origin sepsis，GOS），是一種由腸道感染引發(fā)的全身性反應(yīng)，主要包括引起宿主免疫功能失調(diào)，并最終導(dǎo)致多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，全球每年患病人數(shù)超過(guò)數(shù)百萬(wàn)，死亡率已超過(guò)患病人數(shù)的30%，并且這一數(shù)據(jù)仍在持續(xù)地?cái)U(kuò)大[2]。腸黏膜機(jī)械屏障破壞是誘發(fā)GOS的重要因素，細(xì)菌能夠通過(guò)受損的腸黏膜移位于其他器官組織，從而引起全身性炎癥，最終導(dǎo)致MODS[3]。 緊 密 連 接 蛋 白（tight junction protein，TJP）是腸黏膜機(jī)械屏障重要組成部分，已有大量文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，多種腸道細(xì)菌感染性疾病與TJP的受損相關(guān)[4，5]。occludin和閉鎖小帶蛋白（ZO-1）作為腸上皮重要的TJP，能互相結(jié)合形成穩(wěn)定的連接，對(duì)于維護(hù)腸黏膜屏障的完整性有非常重要的意義[6]。

調(diào)胃承氣湯對(duì)胃腸黏膜受損患者的療效十分顯著，且通過(guò)灌腸途徑給藥能顯著提高臨床療效[7，8]。本研究通過(guò)應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法復(fù)制GOS大鼠模型，觀察和比較調(diào)胃承氣湯灌胃與灌腸2種療法對(duì)模型大鼠腸上皮細(xì)胞緊密結(jié)合蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的影響，從而探討該方對(duì)GOS大鼠腸道屏障的作用機(jī)制及有效給藥途徑，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 48只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44007200047550。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單位為廣東省中醫(yī)研究所SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2010-0059。

1.2 藥物與試劑 調(diào)胃承氣湯由大黃、芒硝、炙甘草組成。大黃（批號(hào)：130908261）、芒硝（批號(hào)：130707541）、炙甘草（批號(hào)：130713191）均購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司。大鼠降鈣素原（PCT）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：694180115）、大鼠D-乳酸（D-LA）ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：254180115）均購(gòu)自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司；occludin抗體（批號(hào)：66378-1-Ig）、ZO-1抗體（批號(hào)：66452-1-Ig）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.3 儀器 Varioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；IQTM5型熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；SmartSpec Plus核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BS224S電子天平（1/萬(wàn)）（德國(guó)SARTORIUS）；5450型小型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；BSA2245型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；IM5-50型全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（常熟市雪科電氣有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）。

1.4 分組與給藥 將大鼠隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組，模型組，中藥灌胃高、低劑量組，中藥灌腸高、低劑量組，每組8只。中藥灌胃組以灌胃方式（10 mL/kg）給予調(diào)胃承氣湯，中藥灌腸組以灌腸方式（3 mL/kg）給予調(diào)胃承氣湯，正常組與模型組以灌胃方式給予等量生理鹽水。調(diào)胃承氣湯的臨床處方量為105 g（大黃60 g、芒硝15 g、炙甘草30 g），以此臨床用量為基礎(chǔ)，換算得出大鼠給藥劑量為9.450 g（生藥）/kg。在造模后2、10、24 h分別給藥，并在第3個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。灌胃高、低劑量分別為9.450、4.725 g（生藥）/kg，按中藥湯劑換算灌胃量分別為3、1.5 mL（最終稀釋至3 mL）。灌腸高、低劑量分別為9.450、4.725 g（生藥）/kg，按中藥湯劑換算灌腸量分別為2.2、1.1 mL（最終稀釋至2.2 mL）。

1.5 模型復(fù)制 采用盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）復(fù)制GOS大鼠模型[9]。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，使用100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。備皮后沿腹中線剪開約2 cm開口，小心取出盲腸置于提前消毒的紗布，用棉簽將糞便趕至盲腸尾端。用傳統(tǒng)代號(hào)為1號(hào)的醫(yī)用真絲編織線結(jié)扎盲腸50%，往盲腸尾端注射1 mL生理鹽水稀釋糞便后用10 mL注射器針頭穿孔3次，輕輕擠壓盲腸使糞便流出后將盲腸小心放回腹腔。逐層縫合切口，腹腔注射37℃5 mL生理鹽水使大鼠生理復(fù)蘇。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.6.1 蘇木素—伊紅（HE）染色觀察小腸組織病理變化 取各組大鼠的小腸組織，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.6.2 ELISA檢測(cè)血清PCT和D-LA水平 嚴(yán)格按照PCT、D-LA ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟操作。

1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)小腸組織occludin、ZO-1基因，肝臟組織TNF-α、INF-γ基因表達(dá) 取各組大鼠同一位置的小腸50 mg、肝臟100 mg，分別提取總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定吸光度D（260 nm）/D（280 nm）比值，分別計(jì)算出小腸和肝臟的RNA濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄的操作按照Invitrogen公司M-MLV First Strand Kit提供的20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行。先加入3 μg總RNA，與Random Hexamer Primer、ddH2O 配制成 12 μL 液體，70℃反應(yīng)5 min，室溫靜置2 min；隨后加入含有Transcriptase的緩沖液8 μL，42 ℃反應(yīng)60 min，94℃反應(yīng)5 min，合成第一鏈 cDNA。根據(jù)GenBank提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用Primer 5.0和Beacon Designer 7.91生物軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。基因表達(dá)的檢測(cè)按照25 μL的反應(yīng)體系來(lái)添加，具體為先加入9.5 μL的ddH2O，而后分別加入1 μL的上游、下游引物，隨后繼續(xù)加入1 μL的cDNA以及12.5 μL Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master（2×）的混合物，最后放入熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增步驟1：94℃×5 min；步驟2：94℃×30 s→55℃×30 s→72℃×50 s（45個(gè)循環(huán)）；步驟3：72℃×7 min。每組10個(gè)樣品，分別取1 μL作為cNDA模板擴(kuò)增，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。具體計(jì)算公式為：

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

1.6.4 免疫組化法檢測(cè)小腸組織occludin和ZO-1的表達(dá) 取小腸組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，蛋白酶K 37℃消化10 min，PBS沖洗。滴加一抗4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，二抗室溫濕盒內(nèi)孵育30 min，DAB顯色1 min，PBS沖洗。DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，PBS代替一抗作空白對(duì)照。免疫組化結(jié)果判斷：細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中見黃色或棕黃色染色定義為occludin和ZO-1的染色陽(yáng)性。200倍光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野下隨機(jī)選取3個(gè)區(qū)域運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析occludin和ZO-1的平均光密度（D）值。指標(biāo)量化數(shù)值的升高或下降即可認(rèn)定為相應(yīng)蛋白表達(dá)的升高或下降。1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析各組間均值的差異，方差齊時(shí)，均值的比較采用SNK法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，均值間的比較采用Dunnett T3法檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 假手術(shù)組大鼠營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)良好，好動(dòng)，皮毛光澤，飲食飲水正常，精神狀態(tài)良好。造模組大鼠精神不佳，皮毛光澤差，自主活動(dòng)減少。與模型組比較，中藥灌胃、灌腸組的大鼠自主活動(dòng)均有明顯增加，精神狀況有所改善。說(shuō)明調(diào)胃承氣湯灌胃、灌腸均可以改善GOS大鼠的精神狀態(tài)、飲食飲水等情況。

2.2 病理結(jié)果 圖1結(jié)果顯示：正常組小腸黏膜結(jié)構(gòu)基本正常，絨毛結(jié)構(gòu)完整有序，無(wú)炎性組織的浸潤(rùn)；模型組腸上皮固有層萎縮變薄，絨毛組織出現(xiàn)了壞死且間隙增大，小腸組織受損嚴(yán)重；中藥灌胃高、低劑量組與中藥灌腸高、低劑量組小腸組織結(jié)構(gòu)基本完整，沒(méi)有出現(xiàn)絨毛組織壞死的現(xiàn)象，且上皮固有層萎縮有改善的跡象。

圖1 各組小腸病理結(jié)構(gòu)比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of the pathological features of small intestinal tissues in various groups（by HE staining，×100）

2.3 ELISA結(jié)果 表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組血清PCT和D-LA水平明顯升高（P＜0.01），表明模型大鼠小腸黏膜屏障受損嚴(yán)重，細(xì)菌感染明顯，提示GOS模型復(fù)制成功；與模型組比較，中藥各治療組均能顯著降低PCT和D-LA的水平（P＜0.05或P＜0.01），其中，中藥灌腸高劑量組的作用較中藥灌胃組更加明顯（P＜0.01），表明調(diào)胃承氣湯能降低GOS大鼠PCT和D-LA血清含量，且灌腸給藥途徑的療效比灌胃給藥更好。

表2 各組大鼠血清PCT、D-LA含量比較Table 2 Comparison of serum contents of PCT and D-LA in various groups (±s)

表2 各組大鼠血清PCT、D-LA含量比較Table 2 Comparison of serum contents of PCT and D-LA in various groups (±s)

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.01，與中藥灌胃高劑量組比較；⑥P＜0.01，與中藥灌胃低劑量組比較

D-LA[c/（nmol·mL-1）]0.18±0.02 0.37±0.04①0.29±0.04③0.27±0.03③0.21 ± 0.04③⑤⑥0.24± 0.03③④組別假手術(shù)組模型組中藥灌胃高劑量組中藥灌胃低劑量組中藥灌腸高劑量組中藥灌腸低劑量組N8 8 8 8 8 8 PCT[ρ/（pg·mL-1）]88.35±9.71 142.00±7.90①114.19±14.76②112.07±34.05②92.75 ± 35.18③⑤⑥103.15±32.21③

2.4 RT-qPCR結(jié)果 表3結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小腸組織occludin和ZO-1基因的相對(duì)表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01），肝臟組織TNF-α和INF-γ基因相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。表明模型大鼠的腸上皮細(xì)胞的緊密結(jié)合蛋白基因表達(dá)異常，腸黏膜屏障有一定程度損傷，且體內(nèi)的炎癥水平升高。與模型組比較，中藥各治療組肝臟組織中TNF-α和INF-γ基因相對(duì)表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），中藥灌胃高劑量組與中藥灌腸高、低劑量組小腸組織occludin和中藥各治療組小腸組織ZO-1基因相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且中藥灌腸高劑量組的上調(diào)作用較中藥灌胃組更明顯（P＜0.01）。表明調(diào)胃承氣湯灌胃、灌腸均能上調(diào)GOS大鼠腸上皮細(xì)胞緊密結(jié)合蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)，修復(fù)腸黏膜屏障，并且降低體內(nèi)炎癥水平。

2.5 免疫組化染色結(jié)果 圖2～4結(jié)果顯示：正常組occludin和ZO-1在腸上皮組織中均呈明顯的陽(yáng)性表達(dá)，為棕色和棕褐色。模型組occludin在上皮組織中也呈陽(yáng)性表達(dá)，較正常組有所減少（P＜0.05），但可見腸內(nèi)也出現(xiàn)了明顯的陽(yáng)性表達(dá)，表

表3 各組小腸occludin、ZO-1，肝臟TNF-α、INF-γ基因表達(dá)比較Table 3 Comparison of gene expression of occludin，ZO-1 in small intestinal tissues and TNF-α，INF-γ in liver tissues of various groups （±s，p）

表3 各組小腸occludin、ZO-1，肝臟TNF-α、INF-γ基因表達(dá)比較Table 3 Comparison of gene expression of occludin，ZO-1 in small intestinal tissues and TNF-α，INF-γ in liver tissues of various groups （±s，p）

INF-γ/18S 1.01±0.17 2.01±0.39①1.21±0.15③1.01±0.14③1.04±0.15③0.91± 0.18③④組別假手術(shù)組模型組中藥灌胃高劑量組中藥灌胃低劑量組中藥灌腸高劑量組中藥灌腸低劑量組N8 8 8 8 8 8 occludin/18S 1.00±0.22 0.48±0.21①0.82±0.19②0.63±0.19 1.20 ± 0.36③⑤⑥1.00± 0.20③⑤ZO-1/18S 1.00±0.28 0.53±0.24①0.86±0.25②0.89±0.20②1.56 ± 0.39③⑤⑥1.20±0.28③TNF-α/18S 1.00±0.22 2.00±0.36①1.15±0.19③0.96±0.19③0.87±0.16③1.01±0.20③

圖2 各組小腸occludin蛋白表達(dá)比較（免疫組化，×400）Figure 2 Comparison of the expression of occludin in small intestinal tissues of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖3 各組小腸ZO-1蛋白表達(dá)比較（免疫組化，×400）Figure 3 Comparison of the expression of ZO-1 in small intestinal tissues of various groups（by immunohistochemistry，×400）

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.01，與中藥灌胃高劑量組比較；⑥P＜0.01，與中藥灌胃低劑量組比較明occludin內(nèi)移，ZO-1在腸黏膜基本上無(wú)明顯棕褐色的分布（P＜0.05），腸內(nèi)也無(wú)轉(zhuǎn)移的跡象。中藥各治療組occludin和ZO-1均有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），沒(méi)有出現(xiàn)往腸內(nèi)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，且在中藥灌胃治療組和中藥灌腸治療組中無(wú)明顯的差異（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠小腸occludin、ZO-1蛋白免疫組化量化結(jié)果Figure 4 Comparison of the quantization of immunohistochemical expression of occludin，ZO-1 in small intestinal tissues of various groups

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膿毒癥的病機(jī)主要是溫邪熱毒，脾胃氣虛，故治則以清熱解毒、健脾益氣為主[10]。調(diào)胃承氣湯出自《傷寒論》，由大黃、芒硝、炙甘草組成，為瀉下劑的代表方。方中：大黃苦寒以泄熱通便，蕩滌腸胃；芒硝咸寒以瀉下除熱，軟堅(jiān)潤(rùn)燥；炙甘草以調(diào)和大黃、芒硝相須之功，使之和緩。三藥共奏緩下熱結(jié)之功，標(biāo)本兼治，適用于無(wú)論是早期還是晚期腸道膿毒癥[11]。文獻(xiàn)研究表明，清熱解毒劑治療膿毒癥的機(jī)制有以下2個(gè)方面：一是抑制血清中內(nèi)毒素及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，提高組織器官抗炎抗氧化能力[12]；二是抵抗膿毒癥時(shí)細(xì)菌或內(nèi)毒素易位[13]。由于腸道功能受損，臨床上口服中藥方劑存在生物利用度差的問(wèn)題，灌腸療法能提高臨床療效，已被廣泛應(yīng)用[14]。

腸道屏障是腸道具有特異選擇性的屏障系統(tǒng)，能保護(hù)機(jī)體免受外源性抗原的損害，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面起關(guān)鍵性作用。緊密連接（tight junction，TJ）是腸上皮細(xì)胞間的主要連接方式，而緊密連接蛋白（TJP）則是對(duì)其連接功能的表達(dá)，TJ對(duì)保持腸上皮細(xì)胞的極性及調(diào)節(jié)腸屏障的通透性起著非常重要的作用。已有大量文獻(xiàn)證明，跨膜蛋白o(hù)ccludin是腸上皮細(xì)胞間重要的TJP之一，相對(duì)分子質(zhì)量為65 000，因具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，可以將其分為2個(gè)細(xì)胞外環(huán)和2個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)，相鄰細(xì)胞就是通過(guò)外環(huán)以拉鏈狀結(jié)合而封閉細(xì)胞旁間隙。而胞質(zhì)附著蛋白ZO-1，同樣作為關(guān)鍵的TJP，能與occludin結(jié)合，形成穩(wěn)定的連接，從而維持腸道屏障的穩(wěn)定性[6]。

當(dāng)腸道暴露在細(xì)菌的感染時(shí)，大量的細(xì)胞炎性因子如TNF-α和INF-γ被釋放，引起TJP分布異常、表達(dá)減少，可導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的異常，細(xì)胞間隙增寬，從而導(dǎo)致內(nèi)皮層通透性升高，為細(xì)菌移位創(chuàng)造了機(jī)會(huì)，而移位后的細(xì)菌繼續(xù)刺激免疫細(xì)胞分泌炎性因子，故形成惡性循環(huán)[15，16]。

PCT和D-LA作為GOS正相關(guān)的代謝標(biāo)志物，在血液中大量積聚。有文獻(xiàn)報(bào)道，血液中D-LA的含量與腸黏膜損傷評(píng)分呈顯著正相關(guān)[17]。

本研究結(jié)果顯示，GOS模型大鼠出現(xiàn)明顯的膿毒癥癥狀，具體表現(xiàn)為血液中特異性標(biāo)志物PCT和D-LA水平升高，肝臟炎性因子表達(dá)上調(diào)，小腸中TJP表達(dá)異常和結(jié)構(gòu)損傷等。而調(diào)胃承氣湯灌腸療法較灌胃療法能更顯著地降低PCT和D-LA在血液中的含量、炎性因子表達(dá)及上調(diào)小腸組織中TJP的表達(dá)，防止細(xì)菌移位對(duì)機(jī)體造成更大的損傷。本研究結(jié)果為臨床上中藥灌腸療法防治GOS提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。