在雙波長下識別Fe3+的一種新型可視化熒光探針的合成及性能

曾 竟， 劉瑞姣， 陳佳敏

(新疆師范大學 化學化工學院， 新疆 烏魯木齊 830054)

1 引 言

過渡金屬和重金屬離子廣泛存在于自然界中，并在生命活動中發揮著重要作用[1-3]，與人類的健康密切相關。其中鐵元素是人體內含量最為豐富的過渡金屬元素，是人體所必需的微量元素之一。它廣泛分布于人體中，幾乎所有組織均含有鐵。它還是血紅蛋白的重要組成成分，是血液中輸送氧與交換氧的重要元素，也是許多酶的組成成分和氧化還原反應酶的激活劑[4]。鐵元素過量或不足對人體均有害處[5-8]。因此，尋找一種可靠的方法檢測生物或環境中的Fe3+顯得至關重要，Fe3+熒光探針的選擇性、高靈敏性與合成也備受關注。

四苯乙烯(TPE)包含4個共軛苯環，具有獨特的聚集誘導發光(AIE)行為，即在分散狀態時熒光十分微弱，但在聚集狀態下熒光強度急劇增大，表現出強熒光行為。自2001年唐本忠教授課題組[9]對AIE效應進行首次報道以來，人們利用四苯乙烯類化合物的AIE性質，設計并合成出大量新型熒光探針并用于金屬陽離子、氰基化合物、巰基、蛋白質等的檢測[10-15]。羅丹明B類有機染料為一類經典熒光母體，其螺內酰胺閉環時溶液為無色，熒光強度較弱，而羅丹明開環結構具有高摩爾吸光系數、剛性共軛結構大、發射波長長、水溶性好等優異性能[16]，同時能產生明顯的熒光、紫外吸收光譜變化和顏色變化。因此,開發并設計新型的高選擇性和高靈敏度的羅丹明衍生物探針[17-24]仍然具有巨大的潛力。

基于上述思路，已合成報道的四苯乙烯官能團化的羅丹明亞胺化合物TPE-RhB[25]未能充分利用四苯乙烯的聚集誘導發光性質來專一性識別金屬陽離子，因此本文將化合物TPE-RhB進一步還原得到新的基于四苯乙烯-羅丹明的雙仲胺化合物L，以期目標化合物能同時發揮四苯乙烯類和羅丹明類化合物的優異熒光性能，在離子識別方面表現出特殊的識別能力。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

紅外光譜由Bruker TENSOR27紅外光譜儀測定；核磁共振數據由美國Varian公司Varian 400-MR (TMS內標，CDCl3做溶劑)測定；紫外吸收光譜由日立U-3310紫外可見分光光度計測定；熒光光譜數據使用Varian Cary Eclipse熒光分光光度計測定；電化學性能由CHI600電化學工作站測定；熔點使用北京泰克儀器有限公司X-4顯微熔點儀測定。

乙醇和四氫呋喃溶液經干燥處理后重蒸得到。實驗中使用的蒸餾水均通過自動三重純水蒸餾器(SZ-97，上海亞榮生化儀器廠)重蒸獲得，其他所用試劑均為市售分析純或化學純。

2.2 化合物L的合成

TPE-RhB按照參考文獻[25]制備且表征數據與文獻一致。

L的合成路線如圖1所示：向帶有磁子的50 mL干燥圓底燒瓶中加入TPE-RhB(0.3 g，0.35 mmol)和10.0 mL無水乙醇，啟動攪拌，待固體完全溶解后，冰浴降至0 ℃以下后，分批加入NaBH4(0.1 g，2.5 mmol)，加入完畢后，緩慢回至室溫，薄層色譜跟蹤反應，6 h左右反應完全后用1 mol/L的HCl溶液猝滅NaBH4的活性，并用1 mol/L的NaOH溶液將體系調至中性，二氯甲烷萃取(3×30 mL)有機相，合并有機層后并用無水硫酸鈉干燥，待干燥透徹后，用旋轉蒸發儀減壓除去溶劑，混合物用石油醚∶乙酸乙酯=8∶1(體積比)為洗脫劑柱層析分離得0.23 g黃色粉末狀固體化合物L，產率 76%。m.p. 142～143 ℃；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:1.13(s，12H)，2.22(s，6H)，2.78(s，4H)，3.29(s，8H)，4.19(s，1H)，4.49(s，1H)，6.25～6.26(m，4H)，6.39～6.42(m，4H)，6.72～7.06(m，16H)，7.48～7.50(m，2H),7.90～7.92(m，1H)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ: 12.6，21.1，21.2，26.9，41.4，44.3，49.5，65.8，97.9，105.8，107.8，111.9，122.8，124.1，125.8，127.4，128.2，128.3，128.4，128.5，131.2，131.3，131.6，132.3，132.7，135.3，141.7，144.9，146.6，148.8，153.9，167.1。

圖1 探針L的合成路線

3 結果與討論

3.1 電化學性質

化合物L和內標物質二茂鐵的電化學性能測試均采用循環伏安法，濃度為1×10-3mol/L，在以四丁基高氯酸銨為支持電解質(0.1 mol/L)的乙醇溶液中進行，玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，Pt絲為對電極，掃描速率為0.05 V/s，在氮氣氛中分正負區掃描得到，掃描曲線見圖2。L含有仲胺結構單元，容易被氧化而得到電子；同時含有羅丹明螺內酰胺結構，容易失去電子被還原而開環，形成氧雜蒽環結構。

從正區的CV曲線中可以得知，它氧化的起始電位為0.41 V，氧化的最大峰電位在0.69 V；根據電離式公式IP=-EHOMO=[Eonset+E(Fc/Fc+)+4.8] eV，得到L的電離勢為5.77 eV，與正電極的功函數(5.5 eV)較匹配，可降低空穴注入的能壘，提高空穴注入效率，因此L還有望開發成為空穴傳輸材料。從負區的CV曲線可以得到還原起始電位為-0.45 V，還原峰值電位為-0.81 V；根據電子親合能公式EA=-ELUMO=[Ered-E(Fc/Fc+)+4.8] eV，得出其電子親合能為3.71 eV，比PBD(EA=2.82 eV)的電子親和能大，有望開發為電子傳輸材料。

圖2 二茂鐵和L的CV曲線圖

Fig.2 Cyclic voltammograms of compounds ferrocene andL

3.2 化合物L的聚集誘導熒光性質

通過熒光光譜法研究了L的聚集誘導發光性質，測試溶液濃度為50 μmol/L，具體結果如圖3所示。

從圖3可以看出，化合物L在水體積分數低于30%時，508 nm處熒光強度較弱；當水體積分數增加至80%時，熒光強度達到最大，為957，比純乙醇溶液時增強478倍，說明L具有典型的聚集誘導發光性質。

圖3 (a)L(50 μmol/L)在不同體積分數的乙醇/水混合溶液中聚集誘導熒光圖(λex=350 nm，λem=508 nm);(b)聚集誘導熒光發射強度趨勢圖(插圖是在可見光與365 nm紫外光下的圖片)。

Fig.3 (a) Emission spectra ofL(50 μmol/L) in EtOH-H2O mixtures with different water fraction(λex=350 nm，λem=508 nm). (b) Plots of maximum emission intensity ofLversuswater fraction in the EtOH-H2O mixture(Inset: photographs of compoundLin EtOH/H2O mixtures under the visible and 365 nm ultraviolet light).

3.3 化合物L的熒光探針性能

3.3.1 最佳實驗條件

為使L達到最優選擇性能，首先按照標準方法配置濃度為0.05 mol/L、pH=7.3的Tris-HCl緩沖溶液，其次量取2.5 mL 5.0×10-4mol/L探針L儲備液到5 mL小瓶中，并使用2.5 mL上述Tris-HCl緩沖溶液調節pH值配置得到50 μmol/L的探針L的乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)待測液，測定紫外吸收和熒光發射光譜，分別進行了pH值和時間對熒光光譜影響的研究。

3.3.1.1 pH值的影響

為了進一步探究L的實用性，本文探討了pH值對L的影響，結果如圖4所示。當pH<4時，熒光發射峰在582 nm處熒光強度隨pH值減小而增大；當pH>4后，熒光強度趨于穩定。由于實際生活環境、生物體系的pH值都比較接近中性條件，因此本論文的熒光識別pH值選擇為7.0。

圖4 在不同pH值下探針L熒光強度的變化圖(黑色曲線：λex=350 nm，λem=508 nm；紅色曲線：λex=530 nm，λem=582 nm)

Fig.4 Emission intensity ofLin different pH conditions (black curve:λex=350 nm，λem=508 nm；red curve:λex=530 nm，λem=582 nm)

3.3.1.2 響應時間

為考察L對Fe3+的識別的靈敏度，在乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)體系中做了響應時間測試，測試結果如圖5所示。實驗結果表明15 min后熒光強度趨于穩定狀態，說明絡合基本完全。因此后續熒光測試選取20 min后進行測試。

圖5L在乙醇/水(50 μmol/L，V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)中的響應時間。(a)λex=350 nm，λem=508 nm；(b)λex=530 nm，λem=582 nm。

Fig.5 Emission intensity ofLin EtOH/H2O(50 μmol/L,V∶V, 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with different time conditions. (a)λex=350 nm，λem=508 nm. (b)λex=530 nm，λem=582 nm.

3.3.2L的選擇性實驗

在上述最優條件下，擬通過可視化識別、紫外-可見吸收光譜、熒光光譜三方面綜合考察L對金屬陽離子的識別能力。首先分別選取聚集誘導熒光較強的50 μmol/LL的水/乙醇(V∶V，7∶3，Tris-HCl pH=7.0)和(V∶V，6∶4，Tris-HCl pH=7.0)體系進行選擇性識別研究，均未實現對某一金屬陽離子的專一選擇性識別。但值得慶幸的是當選擇50 μmol/LL的水/乙醇(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)體系時，可實現對鐵離子的專一性識別。

3.3.2.1 可視化識別

從可見光照射下溶液的圖片(圖6)可以看出，當加入Fe3+后，溶液顏色由無色變成紅色，其他金屬離子無明顯變化。而在365 nm紫外燈照射下觀察發現，當加入Fe3+后，溶液熒光強度顯著降低，加入其他金屬離子后溶液無明顯變化，因此L可以裸眼識別鐵離子。

圖6 向50 μmol/L探針L的乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)中加入10 equiv.不同陽離子后，可見光(a)和365 nm紫外燈(b)下可視化識別情況。

Fig.6 Photographs of 50 μmol/LLin EtOH/H2O (V∶V， 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with the presence of various cations under the visible light(a) and UV illumination(365 nm) (b)

3.3.2.2 紫外-可見吸收光譜

從紫外-可見吸收光譜(圖7)可知，當加入Fe3+后，320 nm處的吸收峰明顯增強，并且在560 nm處出現一個新吸收峰，而加入其他離子和未加Fe3+的體系中未出現類似情況。因此，從紫外-可見吸收光譜圖中也可看出L對Fe3+表現出專一性識別。

圖7 向50 μmol/L探針L的乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)中加入10 equiv.不同金屬離子后的紫外-可見吸收光譜

Fig.7 UV-Vis absorbance spectra of 50 μmol/LLin EtOH/H2O (V∶V， 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with 10 equiv. various cations

3.3.2.3 熒光光譜

熒光光譜實驗結果如圖8所示。未加入金屬陽離子時，508 nm和582 nm處熒光發射峰強度分別為896和17；Fe3+加入后，508 nm處熒光強度急劇減弱，最大發射波長藍移6 nm，表現為熒光猝滅，猝滅比為87.5%，實現了對Fe3+的“turn-off”識別。非常有趣的是伴隨508 nm處的熒光猝滅，582 nm處熒光發射強度則急劇增大，強度較空白溶液增大45倍，對Fe3+實現了“turn-on”識別，而在相同條件下，除Al3+在582 nm處熒光發射峰強度略微增大外，其他金屬離子幾乎未引起熒光強度改變。因此，化合物L表現出對Fe3+特有的選擇性和專一性。

從以上可見光照射下溶液的圖片、紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的實驗結果可以看出，化合物L表現出對Fe3+特有的選擇性和專一性，并且整個識別過程裸眼可見。

圖8 向50 μmol/L探針L的乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)中加入10 equiv.不同金屬離子后的熒光光譜。(a)λex=350 nm，λem=508 nm；(b)λex=530 nm，λem=582 nm。

Fig.8 Fluorescence spectra obtained for 50 μmol/LLin ethanol-water(V∶V， 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) after the addition of 10 equiv. various cations. (a)λex=350 nm，λem=508 nm. (b)λex=530 nm，λem=582 nm.

3.3.3 金屬離子競爭性實驗

為了進一步探究L作為Fe3+探針的實用性，進行了10 equiv. 不同金屬離子與等量Fe3+共存時的干擾實驗，結果如圖9所示。

圖9 向50 μmol/L探針L的乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH 7.0)中加入10 equiv.不同金屬離子和等量Fe3+共存時的熒光強度變化圖。(a)λex=350 nm，λem=508 nm；(b)λex=530 nm，λem=582 nm。

Fig.9 Emission intensity changes of 50 μmol/LLin EtOH/H2O (V∶V， 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with 10 equiv. Fe3+and other cations. (a)λex=350 nm，λem=508 nm. (b)λex=530 nm，λem=582 nm.

在其他金屬離子，向L的乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)溶液加入Fe3+后，由Fe3+引起的熒光猝滅(508 nm)和熒光增強(582 nm)現象基本沒有發生變化，由此說明，L對Fe3+的識別具有較強的抗干擾能力，是一種高選擇性的熒光探針。

3.3.4光譜滴定實驗

利用紫外和熒光滴定實驗進一步研究了L對Fe3+的選擇性，在50 μmol/LL的乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl，pH=7.0)體系中不斷增加Fe3+的濃度，觀察探針紫外吸收強度和熒光強度的變化，結果如圖10和圖12。

3.3.4.1 紫外-可見吸收光譜滴定實驗

紫外吸收光譜顯示(圖10)，Fe3+濃度在0～850 μmol/L之間，隨Fe3+濃度的逐漸增大，327 nm和560 nm處吸收峰均呈現遞增趨勢，溶液顏色呈現出由無色到粉紅色變化過程。Fe3+濃度在500～700 μmol/L之間時，紫外吸收強度與鐵離子濃度有較好的線性關系，相關系數為0.980 9，線性相關曲線如圖11。

圖10 向50 μmol/L探針L的乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl pH=7.0)溶液中逐漸加入0～850 μmol/L Fe3+后的紫外光譜圖

Fig.10 UV-Vis absorbance spectra of 50 μmol/LLin EtOH/H2O (V∶V， 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with 0～850 μmol/L Fe3+

圖11 紫外吸收強度隨Fe3+濃度變化的線性關系圖 (λ=560 nm)

Fig.11 Linear plot ofLfor the different addition of Fe3+ions(λ=560 nm)

3.3.4.2 熒光光譜滴定實驗

從圖12(a)中可以看出，測試Fe3+濃度在0～700 μmol/L之間，在508 nm處的熒光強度隨鐵離子濃度增大而減小，最終趨于穩定。Fe3+濃度在150～450 μmol/L之間有較好線性關系(圖13(a))，經過擬合得到線性回歸方程y=0.927×106x+534.5，R2=0.986 6，并通過檢測限公式D=3Sd/ρ(其中ρ是熒光強度與鐵離子濃度的斜率，Sd是空白標準偏差)得出檢測限D=4.56×10-6mol/L。

然而，L在582 nm處(圖12(b))的熒光發射強度卻呈現出相反的規律，熒光發射強度隨鐵離子濃度增加而增大，Fe3+濃度在0～800 μmol/L之間有較好線性關系(圖13(b))，線性回歸方程y=1.697×106x-392.4，R2=0.994 5，探針L對Fe3+的最低檢測限可達7.4×10-7mol/L。

由此可見L的熒光發射和紫外吸收強度隨著鐵離子濃度的變化而改變，而鐵離子濃度達到10 equiv. 后趨于穩定。實驗結果表明L對Fe3+響應靈敏，且二者具有很好的絡合作用。

圖13 熒光強度隨Fe3+濃度變化的線性關系圖 。(a)λex=350 nm，λem=508 nm；(b)λex=530 nm，λem=582 nm。

Fig.13 Linear plot ofLfor the different addition of Fe3+ions. (a)λex=350 nm，λem=508 nm. (b)λex=530 nm，λem=582 nm.

3.3.5 Job’s曲線

為確定探針L與Fe3+之間的絡合比，通過等物質的量連續變化法(Job’s plot)，配制了L與鐵離子總濃度為10 μmol/L的一系列溶液，L與鐵離子濃度比分別為10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9和0∶10。將熒光發射峰定位在582 nm處測定其強度變化(圖14)。

圖14 探針L和Fe3+的Job’s曲線圖，總濃度恒定為10 μmol/L。

Fig.14 Job’s plot ofLand Fe3+, the total concentration is 10 μmol/L(λex=530 nm，λem=582 nm).

從圖14中可以看出，熒光發射峰處于582 nm、Fe3+摩爾分數為0.4時，熒光發射峰強度達到峰值。這一結果說明L和Fe3+是2∶1絡合，它們通過2∶1的絡合比例形成了比較穩定的絡合物，同時伴隨著很強的熒光。

3.3.6 核磁滴定實驗

利用核磁共振氫譜滴定實驗，進一步得到探針L與鐵離子的絡合機理，如圖15。

圖15 探針L在CD3OD/D2O(1∶1,V∶V)中加入Fe3+(a. 0.0 equiv., b. 1 equiv.) 的1H NMR譜

Fig.151H NMR of probeLin CD3OD/D2O(1∶1,V∶V) upon addition of Fe3+(a. 0.0 equiv., b. 1 equiv.)

由圖15可以看出，L化學位移在(6.2～6.7)×10-6處有兩組峰，它們應歸屬為羅丹明結構中與氧雜環相連的芳氫質子信號峰。當加入1 equiv. Fe3+后，上述兩組峰消失，產生這種現象的原因是由于Fe3+加入誘導羅丹明螺旋內酰胺結構開環與氧雜環的芳環結構改變。

3.3.7 掃描電鏡實驗

為充分了解Fe3+與L的絡合機理，在50 μmol/LL的乙醇/水(V∶V，1∶1, Tris-HCl pH=7.0)體系中進行了掃描電鏡實驗，從圖16可以看到，探針分子L未與Fe3+絡合時，分子處于聚集狀態；當探針分子與Fe3+絡合后，分子由聚集狀態轉變為分散的狀態。

根據上述UV光譜、FL光譜、1H NMR滴定和掃描電鏡結果分析，L由聚集狀態轉變為小顆粒分散態后，溶解度增大，導致508 nm處的熒光強度明顯減弱，熒光發生猝滅。而羅丹明環上氮原子與Fe3+進行配位絡合后，誘導螺內酰胺結構開環，形成了氧雜蒽環結構，共軛結構增大，使得在320 nm處紫外吸收強度隨鐵離子濃度增加而增大，并且在560 nm處出現一個新的吸收峰；同時由于羅丹明螺環內酰胺結構處于開環狀態，導致582 nm處熒光發射強度大幅增大。因此推測探針L與Fe3+的可能絡合模式如圖17所示。

圖16 探針L在乙醇-水混合溶液中形成聚集體(a)和加入10 equiv. Fe3+后(b)的SEM圖

Fig.16 SEM images ofL((a)fw=50%) andLafter addition of 10.0 equiv. Fe3+(b) in ethanol-water(50 μmol/L, 1∶1,V∶V)

圖17 探針L與Fe3+可能的絡合機理

4 結 論

通過對化合物TPE-RhB進一步還原得到一種新型的熒光探針L，并確定了分子結構，研究了該化合物的光電性質。實驗結果表明：化合物L在乙醇/水的混合溶劑中具有典型的聚集誘導發光性質；在兩個不同熒光發射波長下分別實現了對Fe3+的“turn-off”和“turn-on”識別，可以作為一種具有高靈敏性和專一選擇性的可視化Fe3+熒光探針，探針L與Fe3+配位比為2∶1。探針L水溶性良好，可以在乙醇/水(V∶V，1∶1，Tris-HCl，pH 7.0)體系中使用，使其在生物體系、環境水中檢測Fe3+含量方面具有潛在應用價值。該化合物的電子親合勢較大，電離勢為5.77 eV，與正電極的功函數(5.5 eV)較接近，有望開發為性能優良的空穴傳輸材料、電子傳輸材料等。