醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白的方法改進(jìn)研究

劉選梅 陳江

【摘 要】目的：為努力營造安全和諧與環(huán)保的生化實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，針對學(xué)生在《醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白》實(shí)驗(yàn)中容易出現(xiàn)的諸多問題，結(jié)合多年的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，研究硼酸-硼酸鹽緩沖液替代巴比妥緩沖液的實(shí)驗(yàn)效果。方法：在使用DYY-6C電泳儀的基礎(chǔ)上來對醋酸纖維薄膜開展電泳，進(jìn)而分析在使用硼酸-硼酸鹽緩沖液的情況下對醋酸纖維薄膜進(jìn)行電泳而得到血清蛋白的分離圖譜。結(jié)果：在相同實(shí)驗(yàn)條件下每張圖譜都能顯示出明顯的5條區(qū)帶，區(qū)帶分離良好、輪廓清晰。結(jié)論：硼酸-硼酸鹽緩沖液分離血清蛋白電泳實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定且重復(fù)性好。

【關(guān)鍵詞】硼酸鹽緩沖液;醋酸纖維薄膜電泳;血清蛋白

中圖分類號： Q503文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）08-0082-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.035

【Abstract】In order to create a safe，harmonious and environmentally friendly biochemical laboratory environment，aiming at many problems that often appear in the experiment of separation of serum protein by cellulose acetate membrane electrophoresis，the purpose of this paper is to create a safe，harmonious and environmentally friendly biochemical laboratory environment.The experiment effect of boric acid-borate buffer solution instead of barbitone buffer solution was studied based on the laboratory experiment teaching experience for many years.Methods on the basis of DYY-6C electrophoresis，the cellulose acetate film was electrophoresis，and then the separation map of serum protein was obtained by electrophoresis of cellulose acetate film with boric acid-borate buffer solution.Results under the same experimental conditions，each atlas can be obtained.There are 5 obvious zones with good separation and clear outline.Conclusion in the experiment of separation of serum protein with boric acid-borate buffer solution，the results are more stable and reproducible.

【Key words】Borate buffer solution;Cellulose acetate film electrophoresis;Serum protein

醋酸纖維薄膜電泳實(shí)際上屬于區(qū)帶電泳科技的范圍，并以醋酸纖維薄膜充當(dāng)支持物，將醋酸纖維薄膜充當(dāng)支持物來開展蛋白電泳的優(yōu)勢在于簡單、耗時短、容易辨別、不存在吸附等。在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課里，《醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白》作為實(shí)驗(yàn)課的一個基礎(chǔ)項(xiàng)目，之前本實(shí)驗(yàn)室醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白實(shí)驗(yàn)中一直用巴比妥緩沖液，但由于巴比妥屬于鎮(zhèn)靜藥物的范圍，影響了其可得性，而且還有著一定的風(fēng)險。本論文重點(diǎn)探究將巴比妥緩沖液用硼酸=硼酸鹽緩沖液進(jìn)行取代時的實(shí)驗(yàn)效果。從而探討在開展《醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白》的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目里，巴比妥緩沖液被硼酸-硼酸鹽緩沖液取代是否可行。

1 材料、儀器與試劑

材料、儀器

醋酸纖維薄膜（臺州市路橋四生化塑料廠生產(chǎn)）、新鮮人血清北京六一DYY-6C型電泳儀，DYCP-31FA型電泳槽，722型分光光度計。

試劑

1）硼酸-硼酸鹽緩沖液（0.08的離子強(qiáng)度、pH8.6）稱取5.610g硼酸鈉，5.60g硼酸，以及1.316g氯化鈉，用蒸餾水溶解，并定容至1L。

2）染色液：氨基黑10B 0.5g，加入冰醋酸10mL，甲醇50mL，溶解并蒸餾水定容至100mL。

3）漂洗液：乙醇45mL，冰醋酸 5mL，蒸餾水50mL，適用于氨基黑10B染色的漂洗。要特別注意到需要使用密封瓶子來裝漂洗液體和染色液體，要不然會出現(xiàn)部分成分揮發(fā)，導(dǎo)致溶液中不同成分的比例出現(xiàn)變化，進(jìn)而對實(shí)驗(yàn)結(jié)論產(chǎn)生不良影響。

4）洗脫液：0.4mol/L氫氧化鈉溶液，其能夠洗脫氨基黑10B染色。

2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與操作步驟

2.1 浸泡和挑選醋酸纖維薄膜

首先辨別醋酸薄膜纖維的光面和毛面，然后在毛面距邊1.5cm的地方使用鉛筆輕畫出痕跡，以當(dāng)成點(diǎn)樣標(biāo)記。把醋酸纖維薄膜毛面的一面浸泡在放置硼酸鹽緩沖區(qū)的容器中，讓其在溶液中漂浮。如果在短時間達(dá)到濕潤狀態(tài)，而且薄膜展現(xiàn)出相一致的色澤，這意味著薄膜有著十分均衡的品質(zhì);如果達(dá)到濕潤狀態(tài)，薄膜上有著色澤不同的條紋等，這意味著這個薄膜在品質(zhì)方面并不均衡。由于電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果很大程度上都會受到醋酸纖維薄膜品質(zhì)的影響，因此在開展實(shí)驗(yàn)之前挑選的薄膜務(wù)必要滿足品質(zhì)均衡。比如，如果薄膜的厚度不相同就會導(dǎo)致區(qū)帶不平整，不同區(qū)帶之間沒有明確邊界，很難再次取得同等實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。使用鑷子將挑選完成的薄膜壓入到緩沖液里，使其全都被緩沖液浸透，隔夜浸泡。

2.2 制作搭橋

按照實(shí)驗(yàn)所需電泳槽的尺度，裁剪出33cm×12cm的紗布，然后將其折疊后放置于電泳槽的支架，將紗布一邊和支架邊緣重合，另一邊浸到緩沖液中。直到紗布都被緩沖液浸濕以后，使紗布緊貼在支架上 ， 即為搭橋。搭橋完成，將電泳槽里添加硼酸-硼酸鹽緩沖液至水平線，最終讓兩邊緩沖液的液面完全相等，要不然在經(jīng)過薄膜的過程中會出現(xiàn)虹吸狀況，最終對蛋白質(zhì)分子的電泳時間造成影響。

2.3 點(diǎn)樣器的制作

把質(zhì)地均勻的蓋玻片通過玻璃刀剪切成寬度為1㎝的點(diǎn)樣器，并打磨其邊緣，將其清潔備用。

2.4 點(diǎn)樣

取出完全浸透的薄膜，放置在干凈的濾紙中央，并去除過多的緩沖液進(jìn)而防止出現(xiàn)樣品擴(kuò)散的現(xiàn)象，然而也不能吸取太多，要不然會導(dǎo)致樣品難以通過薄膜網(wǎng)孔，進(jìn)而導(dǎo)致電泳起點(diǎn)各式各樣，不盡相同，最后對分離結(jié)果產(chǎn)生不良影響;之后在點(diǎn)樣支持物上安置薄膜毛面，點(diǎn)樣器吸取合適分量的血清，將其垂直印在薄膜毛面距邊界1.5㎝的地方，詳細(xì)信息由圖1所示。點(diǎn)樣過程中要保證平穩(wěn)的力度，防止區(qū)帶內(nèi)有斑點(diǎn)發(fā)生。

2.5 電泳

把點(diǎn)樣完成的薄膜將點(diǎn)樣面向下貼于陰極電泳槽的濾橋，點(diǎn)樣區(qū)帶和電泳槽之間距離大約保持在10mm，必須讓其保持距離;把另一側(cè)貼于陽極電泳槽的支架，兩側(cè)務(wù)必要和濾橋密切貼合，務(wù)必不要?dú)馀莩霈F(xiàn)，而且中間確保不出現(xiàn)下垂現(xiàn)象。薄膜間要有超過2mm的間距，只有保持距離才能夠讓血清位于原本的薄膜之上;而且薄膜和濾紙橋之間要保持垂直，薄膜和電流的趨勢保持一致，要不然會產(chǎn)生電泳區(qū)帶地點(diǎn)出現(xiàn)偏移。將電泳槽的蓋蓋上，讓薄膜在10分鐘內(nèi)保持平衡。達(dá)到平衡就能夠開展電泳。在電泳過程中，電泳儀需設(shè)置電壓120V，0.4到0.6mA/cm的電流，電泳耗時為一個小時，取得預(yù)期結(jié)論。電泳區(qū)帶平整，界限明顯，區(qū)帶分離清晰。要十分注意，由于電泳槽、薄膜數(shù)量和電泳儀之間的差異，實(shí)驗(yàn)室提供的電流條件和電壓條件也有著差異，所以要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行測算。而且在通電過程中千萬不要直接觸摸薄膜或者緩沖液，避免出現(xiàn)觸電狀況。

2.6 染色

完成電泳，立刻關(guān)閉電源，將薄膜拿出后放進(jìn)染色液里，進(jìn)行10分鐘的染色。在染色環(huán)節(jié)要經(jīng)常微晃染色器皿，達(dá)到理想的染色效果。當(dāng)有著很多數(shù)量的薄膜條，要防止出現(xiàn)因?yàn)橄噙B而沒有均勻染色的狀況。

2.7 漂洗

在實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)里，通過反復(fù)漂洗的手段，然而以節(jié)約為主，將之前的6次漂洗更改為3次，也就是用3個器皿裝著漂洗液，所有漂洗液的容量都是500ml，然后從染色液里取出薄膜，盡可能地去除染色液，通過鑷子夾住薄膜在培養(yǎng)皿里進(jìn)行3次不間斷的擺動，一直持續(xù)到背景被漂洗干凈。

2.8 拍照

將薄膜放置于清潔濾紙之間，將過多的水分吸掉，經(jīng)過風(fēng)干再對其拍照。

2.9 定量

挑選在同等實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中，有著比較理想的醋酸纖維素薄膜，然后剪掉蛋白質(zhì)的不同色帶以及一條空白帶，將其對應(yīng)放置在六個不同試管里，使用氫氧化鈉溶液（0.4mol/L）對其進(jìn)行洗脫，三十分鐘以后在722型分光光度計的基礎(chǔ)上于620nm波長的環(huán)境下開展色澤對比，最終計算不同實(shí)驗(yàn)組中所含有蛋白的百分比。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在本實(shí)驗(yàn)室開展試驗(yàn)的過程中，使用0.4-0.6mA/cm的電流，120V電壓，電泳耗時為45分鐘到60分鐘。電泳的區(qū)帶整齊、分明，區(qū)帶之間分離徹底。本次實(shí)驗(yàn)過程中還認(rèn)真探索和完善了點(diǎn)樣環(huán)節(jié)、染色環(huán)節(jié)等，而且取得了預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。

硼酸-硼酸鹽緩沖液能替代巴比妥緩沖液，《醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白》在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行環(huán)節(jié)，必須要嚴(yán)格按照上述環(huán)節(jié)開展，能夠達(dá)到95%的實(shí)驗(yàn)成功率。在優(yōu)化以后有著比較良好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)效果。所以，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)里，使用優(yōu)化之后的實(shí)驗(yàn)步驟在一定程度上能夠增強(qiáng)教學(xué)質(zhì)量。

從圖3能夠看出實(shí)驗(yàn)電泳圖譜，圖中從下到上的區(qū)帶是，γ-球蛋白區(qū)帶、β-球蛋白區(qū)帶、α2-球蛋白區(qū)帶、α1-球蛋白區(qū)帶以及血清清蛋白區(qū)帶，能夠看出區(qū)帶分離取得很好的效果，有著清楚的邊界，明顯的顯示出5條區(qū)帶。

4 結(jié)論

電壓與電泳時間是影響電泳結(jié)果的兩個重要因素，在同等的實(shí)驗(yàn)條件中，硼酸-硼酸鹽緩沖液分離的人血清蛋白電泳圖譜十分清楚，通過電泳得到的圖譜，其結(jié)論十分平穩(wěn)有著較高的重復(fù)度，而且生產(chǎn)花費(fèi)較少，在學(xué)生進(jìn)行生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的過程中這種方法比較適用。

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