氯氰菊酯降解過程中的穩定同位素分析

章喜昌

【摘 要】通過測定氰戊菊酯在不滅菌土壤和滅菌土壤中碳同位素比值變化明確微生物降解氰戊菊酯過程會產生顯著的穩定碳同位素分餾效應，從而說明穩定同位素技術可以應用于氰戊菊酯微生物降解的定性評估。

【關鍵詞】碳同位素;氰戊菊酯;同位素分餾

中圖分類號： X172 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）08-0187-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.081

【Abstract】By measuring the carbon isotope ratios of fen valerate in sterilized and non-sterilized soils， it is clear that the process of microbial degradation of fen valerate will produce significant stable carbon isotope fractionation effect， which indicates that stable isotope technology can be applied to qualitative assessment of microbial degradation of fen valerate.

【Key words】Carbon isotope; Fen valerate; Isotope fractionation

穩定性同位素技術從20世紀60年代開始定型并逐步發展起來的一門分支學科，在礦床學、醫學、生物工程、食品 工程等研究領域廣為應用，[1-2]由于其分析結果精確可靠、故已被廣泛應用于環境污染物的來源分析與示蹤研究。

在研究環境中有機污染物降解過程的疑惑之一在于它們可以通過多種過程被降解，比如有氧和厭氧降解，生物和非生物轉化等。而通過穩定性同位素分析技術，我們很方便的確認污染物降解的主導過程及其同位素富集因子，并識別其反應機理。有機污染物的降解途徑受環境條件（如氧氣含量，酸堿度）的影響，并產生同位素分餾差異。Rosell等）研究了甲基叔丁基醚（MTBE）在有氧降解（C-H鍵氧化）、厭氧降解（SN2反應）和酸性水解（SN1反應）時的C和H同位素分餾，Elsner[8]對這些不同降解途徑的δ13C和δD值分別進行了線性回歸分析，發現δ13C和δD呈現出較好的線性相關關系。因此，我們可以用穩定同位素分析技術研究污染物的降解途徑，從而揭示其降解機理。

定量評估農藥的微生物降解一直環境研究熱點之一，傳統方法在評估環境中農藥的微生物降解時，是通過測定一些微生物活性指標來定性和定量的，如底物和電子受體濃度的降低，微生物量和降解產物的增長等，但這些基于濃度的指標并不能真實反映農藥的微生物降解。一些自然過程，如揮發、稀釋和吸附等，也會引起農藥濃度的變化，而農藥本身并沒有發生降解。此外，在復雜的自然環境體系中很難準確獲得底物、電子受體和降解物的物料平衡。有研究表明，在微生物降解過程中，包含輕同位素（如12C）的鍵反應速率相較于重同位素更快，引起重同位素（如13C）在殘留的農藥中富集。因此，我們可以利用穩定同位素分析技術研究同位素組成與生物降解率的關系，從而對農藥的微生物降解進行定性分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與耗材

IsoPrime 100 同位素比質譜儀，配備Agilent 7890A 氣相色譜儀和GC-V燃燒轉化爐，購自英國GV公司;XPE26C 微量分析天平，購自瑞士MettlerToledo 公司;氦氣（純度>99.999%）、氧氣（純度≥99.9992%）、二氧化碳（參考氣，純度≥99.9995%），均購自上海比歐西氣體工業有限公司;

IAEA600 咖啡因（δ13C=-27.771‰），購自國際原子能機構，作為參考氣校準物質和質量控制標準物;氰戊菊酯（fen valerate）固體標樣，純度為99.7%

1.2 樣品處理

土壤樣品采自農田表層土（0～10cm深），在陰暗干燥，壓碎土塊，剔除石塊、動植物殘體等雜物后，再鋪成薄層，使其自然風干，過2mm的篩用于實驗。

取20個50mL錐形瓶（帶橡膠塞），用分析電子天平稱取5.0000±0.0250g土壤樣品分別加入錐形瓶中并使其在瓶底攤平，用1mL移液槍在每個錐形瓶中均勻噴灑3mL的自來水，塞上橡膠塞后稱量記錄下每個錐形瓶的總質量。將錐形瓶放入恒溫搖床，以30℃，120r/min振蕩30min，然后放入恒溫培養箱，在30℃下避光培養2周。

從恒溫培養箱取出錐形瓶，均分為A、B兩組，將A組置于高壓滅菌鍋，在121℃下滅菌3次，每次20 min。然后再將A、B兩組分別均分為A1、A2組和B1、B2組，用1mL移液槍在A1和B1每個瓶中均勻噴灑1mL濃度為10mg/L的氰戊菊酯標準溶液，在A2和B2中均勻噴灑1.5mL濃度為50mg/L的氰戊菊酯標準溶液。

將錐形瓶置于恒溫搖床以30℃，120r/min振蕩10min，使氰戊菊酯均勻分布于土壤樣品中，待正己烷揮發殆盡后塞緊瓶塞，通過稱重在A、B組中分別補加滅菌的和不滅菌的自來水后再塞緊瓶塞。再放入恒溫培養箱，在30℃下避光培養。

每隔15天從培養箱中取出A1、A2、B1和B2各三個樣品用于分析其中氰戊菊酯的碳同位素組成（δt13C）：選用索氏提取法提取土壤中的氰戊菊酯：連接好索氏提取裝置，用正己烷索提洗滌玻璃纖維濾筒和棉花8小時后，將正己烷換成160 mL的索氏提取液（正己烷：丙酮/v：v=7：1），在錐形瓶中加入適量無水硫酸鈉，與土壤樣品攪拌均勻后全部轉移至玻璃纖維濾筒中，連接好索氏提取裝置，索氏提取24小時后將索提管及濾筒中的提取液一并轉入平底燒瓶中。在45℃水浴溫度，75r/min轉速和450hPa初始壓力下用旋轉蒸發儀對提取液進行濃縮，隨著提取液的不斷減少，逐步降低壓力，最后在360hPa壓力下濃縮至1～2mL。

用正己烷濕法裝柱，在玻璃層析柱中裝好填料，從下到上依次為5g無水硫酸鈉、5g弗羅里硅土、3.5g硅膠和5g無水硫酸鈉。然后將濃縮后的提取液轉移到層析柱，用100 mL的洗脫液（正己烷：丙酮/ v：v=9：1）進行洗脫，并收集于平底燒瓶。在45℃水浴溫度，75r/min轉速和400hPa初始壓力下用旋轉蒸發儀對柱后洗脫液進行濃縮，隨著洗脫液的不斷減少，逐步降低壓力，最后在360hPa壓力下濃縮至1～2mL。

將濃縮后的柱后洗脫液氮吹至近干，用100μL正壬烷溶解轉移至150μL玻璃內襯管進GC-C-IRMS分析氰戊菊酯的同位素組成（δt13C）。

1.3 數據處理

其中，R（13C/12C）sample是有機化合物樣品中的碳同位素比值，R（13C/12C）standard是國際標準物質中的碳同位素比值，碳同位素的國際標準物質是美國南卡羅來納州白堊系皮狄組的美洲擬箭石（PDB），相對差值δ一律用千分數表示，樣品結果允許標準偏差為<0.3‰。如果測得的δ值是正的，表示樣品相比于標準13C富集，反之，則表示樣品相比于標準13C貧化。

2 結果與討論

隨著培養時間的推移，氰戊菊酯的δ13C值的測定結果如圖1所示。經過60天的培養，在非滅菌組中觀測到了顯著的穩定碳同位素分餾，加標濃度為2mg/kg的土壤中氰戊菊酯的δ13C值從-28.62±0.31‰上升到-25.54±0.19‰，而加標濃度為15mg/kg的土壤中氰戊菊酯的δ13C值從-28.62±0.31‰上升到-26.78±0.28‰。以此同時，滅菌土壤中氰戊菊酯的δ13C值只發生了非常不顯著的變化。實驗結果表明，主要引起氰戊菊酯降解過程中碳穩定同位素分餾的是微生物降解，而不是非生物降解。

眾所周知，在代謝特定某些有機質過程中，微生物傾向于利用分子中的較輕同位素（例如12C），從而導致剩余有機質中含重同位素（例如13C）的增加，從而導致同位素分餾現象的發生。盡管如此，在某些特定的環境中，微生物降解與穩定同位素分餾并不完全存在著因果關系。實驗中發現殘留氰戊菊酯的δ13C值的明顯增加說明了氰戊菊酯的微生物降解能引起穩定碳同位素分餾現象，這表明應用穩定碳同位素分析技術來指示氰戊菊酯的衰減過程中存在微生物降解并進一步評估其生物降解率成為了可能。

3 結論

通過碳穩定同位素質譜技術，我們比較了氰戊菊酯在不滅菌土壤和滅菌土壤中碳同位素比值隨著培養時間的變化情況。實驗結果表明：氰戊菊酯在土壤中的非生物降解過程對穩定碳同位素比值δ13C的變化沒有產生明顯作用，而微生物降解過程引起了顯著的穩定碳同位素分餾，因此，穩定同位素分析技術可以應用于氰戊菊酯衰減過程中微生物降解的定性評估。

【參考文獻】

[1]林光輝.穩定同位素生態學.北京：高等教育出版社，2013：5.

[2]白志鵬，張利文，彭林，等.穩定性同位素在污染物溯源與 示蹤中的應用[J].城市環境與城市生態，2006，19（4）：29-32.