品種和營養水平對豬背最長肌肌糖原和肌纖維類型的影響

李登赴，郎洪權，何 軍

(1. 四川農業大學動物營養研究所動物抗病營養教育部重點實驗室，四川 成都 611130；2. 貴陽市畜牧站，貴州 貴陽 550081；3. 貴陽市草地站，貴州 貴陽 550081)

【研究意義】肌糖原含量和肌纖維特性是影響豬肉質的重要因素。在眾多影響肉質的因素中，肌纖維類型被認為是調控肉質的關鍵因素[1-2]，肌纖維占肌肉的75 %～90 %，根據肌纖維的收縮特性可將其分為不同的類型，由不同類型的肌纖維組成的肌肉存在較大差異[3]。而肌糖原含量是影響肉質的本質所在[4]，Hamilton等[5]研究表明，豬背最長肌中的糖酵解潛力(GP)和葡萄糖濃度與肉質具有很好的相關性，可通過糖酵解潛力和葡萄糖濃度來預測肉質。【前人研究進展】本研究室在前期的研究發現，高坡豬和 “杜×長×太”三元雜交豬(DLT)的肉質存在顯著差異，不同營養水平對肉質的影響不同[6]，但營養水平對高坡豬和DLT的肌纖維類型及肌糖原含量的影響如何尚未見報道。因此，研究調控不同品種和營養水平間肉質差異的內在機制具有較大生產意義。【本研究切入點】本試驗選用體型相近的高坡豬與DLT為試驗對象，飼喂不同營養標準配制的全價飼糧，研究不同營養水平對高坡豬、DLT背最長肌肌纖維類型和肌糖原含量的影響。【擬解決的關鍵問題】旨在探討營養水平對高坡豬和DLT背最長肌肌纖維類型和肌糖原含量的影響，為深入認識肌纖維類型、糖原含量與肉質的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與動物

試驗采用2×2因子設計，主效應分別為品種(高坡豬、DLT)和營養水平[NRC(2012)、中國豬飼養標準(2004)]。選擇初始體重為(61.16±4.13) kg的DLT和高坡豬各12頭，分為4個處理：DLT中國豬飼養標準(DLT+C)，DLT NRC飼養標準(DLT+N)，高坡豬中國豬飼養標準(高坡豬+C)，高坡豬NRC飼養標準(高坡豬+N)。

1.2 試驗飼糧

飼糧為玉米-豆粕型飼糧，參考NRC(2012)及中國豬飼養標準(2004)相應階段營養需要配制，飼糧組成及營養水平見表1。

1.3 飼養管理

試驗在四川農業大學動物營養研究所教學科研試驗基地進行。單欄飼養，預試5 d后進入正式試驗。每日飼喂3次(08:30，13:30，18:30)，少喂勤添，喂料量以料槽內略有剩余為度。試驗豬自由飲水，圈舍內溫度保持在18～20 ℃。

1.4 屠宰及組織取樣

屠宰分批進行，當試驗豬平均體重達90 kg時，選擇體重較大的5頭豬進行屠宰，分離左側胴體，迅速在胸腰椎結合處按肌纖維走向切取2.0 cm×1.0 cm×1.0 cm背最長肌肌肉樣2份，投入液氮中保存用以制作冰凍切片，分析肌纖維密度、直徑；另取一部分液氮速凍，用以分析肌纖維類型。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 背最長肌肌糖原含量 背最長肌肌糖原含量采用南京建成生物工程研究所肌糖原含量測定試劑盒測定，嚴格按照說明書操作。

1.5.2 背最長肌肌纖維直徑和密度 取解凍后修成1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm的肌肉塊，用冰凍切片機切成厚2～8 μm的切片，快速HE染色后中性樹膠封片。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) (%)

注：N：NRC(2012)；C：中國豬飼養標準(2004)，下同；1．維生素預混料為每千克飼糧提供：VA 1200000 IU, VD3300000 IU, VE 750 IU, VK3150 mg, VB160mg, VB2480 mg, VB6180 mg, VB120.9 mg, 泛酸750 mg, 葉酸15 mg, 煙酸105 mg, 抗氧化劑15 mg；2．礦物質預混料可為每千克飼糧提供: 鐵100 mg, 銅5 mg, 鋅80 mg, 錳3 mg, 碘0.14 mg, 硒0.25 mg；3．營養水平為計算值。

Notes: N: National Research Council (2012); C: Chinese Feeding Standard of Swine (2004),The same as below;1.Vitamin premix provides the following per kilogram of diet: VA 1200000 IU, VD3300000 IU, VE 750 IU, VK3150 mg, VB160mg, VB2480 mg, VB6180 mg, VB120.9 mg, pantothenate 750 mg, folic acid 15 mg, niacin 105 mg, antioxidants 15 mg;2.Mineral premix provides the following per kilogram of diet: Fe 100 mg, Cu 5 mg, Zn 80 mg, Mn 3 mg, I 0.14 mg, Se 0.25 mg;3.Calculated values for nutrients.

背最長肌肌纖維直徑：將切片置于10×40倍顯微鏡下，用多媒體彩色病理圖像分析儀進行測定。由于肌纖維橫截面積常為不規則圖形，無法精確測量其直徑。因此本試驗參考橢圓形長短軸的測量方法求直徑，每個樣品測量45條肌纖維。

表2 目的基因與內參基因引物序列

背最長肌肌纖維密度：將切片置于10×10倍顯微鏡下，用多媒體彩色病理圖像分析儀進行測定。隨機選15個視野，統計肌纖維數，求均值后換算成每平方毫米內的肌纖維數。

1.5.3 背最長肌肌纖維類型 總RNA提取：組織總RNA的提取采用RNAiso Reagent試劑盒(TaKaRa，中國，大連)，將保存于超低溫冰箱的背最長肌樣品按照試劑盒的說明書提取組織總RNA。待RNA干燥后用DEPC水溶解，檢測所提取RNA的濃度和完整性。

引物設計：根據GenBank公布的MyHCI、IIa、IIb、IIx和18S-rRNA的基因序列來設計引物并檢測引物的特異性，以18S-rRNA作為內參。引物由Invitrogen公司合成，目的基因和18S-rRNA基因RT-PCR擴增引物參數見表2。

cDNA合成：cDNA的合成采用SYBR Prime ScriptTMRT-PCR試劑盒(TaKaRa，中國，大連)，嚴格按說明書操作。

標準曲線制作：目的基因和18S-rRNA基因的標準曲線各6個點，每點3個重復。經反轉錄反應后的cDNA溶液，使用EASY Dilution將cDNA溶液按106、107、108、109、1010和1011濃度梯度稀釋后，各取1 μl進行實時熒光定量PCR反應。

實時熒光定量PCR：采用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，中國，大連)對內參和目的基因進行PCR擴增。反應體系10 μl：包括5 μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、上下游引物各1 μl (4 μM)、DEPC水2和1 μl cDNA(10 ng)。反應條件：95 ℃預變性10 s，95 ℃變性5 s, 退火25 s(退火溫度見表2)，40個循環。擴增完后進行熔解曲線分析，溫度從65～95 ℃，每0.5 ℃讀板1次，每次持續0.5 s，連續檢測熒光。

1.6 數據統計與分析

MyHCI、IIa、IIb、IIx基因相對表達量用2-△△Ct法計算[7]。試驗數據采用Excel 2010進行整理，采用SAS 9.0軟件的一般線性模型(GLM)程序對試驗數據進行雙因素分析，并用Duncan氏法進行多重比較。結果以平均值和標準差表示，當P<0.05時差異顯著，當P<0.01時差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 品種和營養水平對豬背最長肌肌糖原含量的影響

由圖1可見，品種和營養水平對豬背最長肌肌糖原含量有極顯著影響，在同樣營養水平下高坡豬豬背最長肌肌糖原含量均極顯著高于DLT(P<0.01)，高營養水平均極顯著降低了DLT和高坡豬的背最長肌肌糖原含量(P<0.05)。

2.2 品種和營養水平對豬背最長肌纖維直徑和密度的影響

由圖2可知，品種對豬背最長肌肌纖維直徑和密度均有較大影響，高坡豬的背最長肌肌纖維直徑極顯著小于DLT(P<0.01)，而密度極顯著大于DLT(P<0.01)，營養水平提高了豬背最長肌肌纖維直徑和降低了密度，但差異不顯著。

數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).The same as below圖1 品種和營養水平對豬背最長肌肌糖原含量的影響Fig.1 Effects of breed and nutrient level on muscle glycogen of LM of pigs

圖2 營養水平對豬背最長肌肌纖維直徑(A)和密度(B)的影響Fig.2 Effects of breed and nutrient level on fiber diameter (A)and density (B)of LM of pigs

2.3 品種和營養水平對豬背最長肌肌纖維類型的影響

由圖3可知，品種和營養水平對豬背最長肌MyHCIIb有較大影響，高坡豬的背最長肌MyHCIIb均低于DLT，在中國豬飼養標準下高坡豬極顯著低于DLT(P<0.01)，在NRC飼養標準下不顯著(P>0.05)；營養水平均極顯著提高了DLT和高坡豬的背最長肌MyHCIIb的相對表達量(P<0.01)。品種和營養水平對MyHCIIx比例有顯著的互作效應，營養水平升高顯著提高了DLT豬背最長肌MyHCIIx型纖維比例(P<0.05)，而對高坡豬的背最長肌MyHCIIx型纖維比例無顯著影響(P>0.05)。此外，品種和營養水平對豬背最長肌 MyHCI和IIa型纖維比例無顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

肌糖原含量是影響最終pH的一個重要因素[8]，豬AMPK的γ亞基PRKAG3的點突變，導致了豬肌肉中葡萄糖代謝包括糖原儲備的紊亂，進而引起酸肉的發生[8]。但關于高坡豬和DLT背最長肌肌糖原含量與最終pH的相關性尚不明確。李夢云等[9]在100 kg階段，漢普夏豬骨骼肌中肌糖原含量顯著高于長撒豬，pH24 h顯著低于長撒豬，而pH45min則差異不顯著。Henckel等[10]研究結果也表明，肌糖原含量與最終pH呈負相關性。研究表明，飼喂相同營養水平的飼糧，高坡豬宰后45 min到24 h之間背最長肌pH的降低較DLT緩慢[6]。在本試驗中，高坡豬背最長肌肌糖原含量高于DLT，表明高坡豬較高的肌糖原含量在一定程度上延緩了pH的降低。而高營養水平飼糧降低了高坡豬和DLT的背最長肌肌糖原含量，這與潘洪彬等[11]高能量和高蛋白質日糧均可加快烏金豬肝糖原和肌糖原合成的結論相反。造成此差異的主要原因可能是飼養條件和品種的差異。

圖3 品種和營養水平對豬背最長肌MyHCI(A)、MyHCIIa(B)、MyHCIIx(C)和MyHCIIb(D)相對表達量的影響Fig.3 Effects of breed and nutrient level on MyHCI (A)，MyHCIIa (B)，MyHCIIx (C) and MyHCIIb (D) relative expression in LM of pigs

肌纖維的直徑和密度是影響肉質的重要指標，肌纖維直徑越小而密度越大的品種其肌內脂肪沉積越多[12]。本試驗結果表明，高坡豬和DLT的背最長肌肌纖維直徑和密度存在一定差異：高坡豬的背最長肌肌纖維直徑小于DLT，而密度大于DLT。這可能是高坡豬雖然生長速度緩慢，但肉質較好的原因。李登赴等[6]對比了高坡豬和DLT的肉質，結果也表明高坡豬肉質優于DLT。在本試驗中，營養水平升高僅顯著增加了DLT的背最長肌肌纖維直徑，而對高坡豬和DLT肌纖維密度無顯著影響。由此推測，影響肌纖維直徑和密度的主要因素是品種。但營養與品種間互作效應對肌纖維的影響還有待進一步研究。近年來雖然通過環境條件控制、營養改進及遺傳育種等手段調控豬產肉性能有了明顯改善且瘦肉率及生長發育速度也得以提高，但也同時降低了豬的肉質，在以后的豬研究中，重點在于如何尋找幾者之間的平衡點。

品種對肌纖維類型百分組成的影響，具有中等以上的遺傳力(h2=0.2～0.59 )，其中I和IIb型肌纖維比例具有高遺傳力，分別為0.46和0.58[13]。本實驗中兩品種背最長肌MyHCIIb型纖維表達差異極顯著，表現為高坡豬IIb型肌纖維極顯著低于DLT。高坡豬和DLT的差異是長期不同生長環境影響的結果，豬出生后肌纖維數目不再發生變化肌肉生長速度主要由肌纖維體積決定。此結果與以往國內很多結論一致，楊曉靜等[14]通過比較二花臉豬和大白豬背最長肌肌纖維組成差異發現，大白豬90 d后IIb型肌纖維顯著高于二花臉豬，IIb型肌纖維比例的顯著增加可能與其肌肉快速沉積有關；楊飛云等[15]研究了地方品種榮昌豬與杜×長×大豬背最長肌肌纖維組成差異發現，杜×長×大豬背最長肌含有更多的IIb型肌纖維。同時中國地方品種對比對國外品種也得到類似結果，如金華豬[16]、二花臉豬[15]、梅山豬[17]和萊蕪豬[18]等中國地方品種和國外瘦肉型品種的肌纖維類型，發現中國地方品種的背最長肌中氧化型纖維含量較高。

由于豬的肌纖維增殖在出生前就已完成，故出生后的營養狀況不會影響肌纖維數，主要影響肌纖維的肥大與類型轉化。營養不良可顯著降低肌纖維大小，且對快速酵解II型肌纖維的影響程度較其他類型的大[19-20]。本試驗結果也表明，營養水平升高顯著提高了高坡豬背最長肌MyHCIIb型纖維表達量，而MyHCI、IIa和IIx無顯著變化。楊飛云等[21]認為出生后營養還可調控MyHC異構體的表達，進而影響肌纖維類型的轉化和肌肉表達。但是營養調控的作用機制還未見相關報道，尤其是營養水平對生長豬肌纖維類型的影響機制。

肌纖維類型是決定肉品質的一個重要因素[22-24]，它與肉品的pH、風味和顏色密切相關。表達不同MyHC異構體的肌纖維具有不同的代謝特性，MyHC I, IIa, IIx和IIb型肌纖維的有氧代謝強度依次遞減[25]。經過長期的集約化選育，現代快速生長的豬種在顯著提高瘦肉率產量的同時也提高酵解型肌纖維的比例，降低氧化型肌纖維的比例，使肌肉代謝發生變化，從而導致肉品質下降[15]。因此，品種是決定肉質的主要因素之一，不同品種的豬之所以肉品質不同，歸根結底是由于肌纖維類型不同，這也是中國地方品種豬肉質優良的原因。

4 結 論

綜上所述，品種和營養水平對豬肌糖原含量、肌纖維組織學特性和類型均有不同影響，高坡豬和DLT的背最長肌肌纖維直徑、密度和肌纖維類型差異較大，同時營養水平對兩品種背最長肌肌糖原含量和MyHCIIb型肌纖維影響也較大。在本試驗中，高坡豬的背最長肌肌纖維直徑和MyHCIIb型肌纖維均極顯著低于DLT，密度也極顯著大于DLT，這可能與李登赴等[6]高坡豬優良的肉質相關。今后肌纖維類型的轉化及其調控因素，肌纖維類型與肉品質之間的關系等還需要更加深入的研究。