棉花誘變種質Gh14-3-3L基因的Eco-TILLING分析

葉春秀，王志軍，趙曾強，莊振剛，馬盼盼，楊永林

(1.新疆農墾科學院/作物種植創新與基因資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832000；2.新疆農業大學，新疆 烏魯木齊 830000；3.石河子農業科技開發研究中心棉花研究所，新疆 石河子 832000)

【研究意義】TILLING 技術作為反向遺傳學技術之一，已在部分主要作物種質創新過程中得到了廣泛的應用，已成功地應用于小麥[1-3]、玉米[4-5]、花生[6-7]、水稻[8-9]、向日葵[10]、大豆[11-12]、高粱和油菜[13-16]等作物的育種及功能基因組學研究中，取得了不少研究成果，并且建立了相關的 TILLING育種技術平臺。快速鑒定突變種質是TILLING技術應用過程中的一個重要步驟，傳統的鑒定方法較為繁瑣且費用昂貴。【前人研究進展】Eco-TIllING技術是通過 TILLING 技術去找尋自然群體中等位基因變異的技術，在生物基因多態性的檢測上較為直觀與直接，在擬南芥[17]、大麥[18]、小麥[19]等多種植物中得到廣泛應用[20-21]。【本研究切入點】棉花作為主要的經濟作物之一，TILLING 技術的應用與其它作物育種相比有所欠缺[22-23]，將后基因組時代的相關技術應用到棉花育種過程中將是一個必然的發展趨勢和方向，TILLING 技術在棉花育種中是否存在著相同的應用價值及應用過程中存在的關鍵性問題，值得深入研究。【擬解決的關鍵問題】本文擬在通過對前期采用TILLING技術創制的棉花種質資源進行表型性狀和分子生物學水平的鑒定，驗證TILLING技術在棉花種質創新方面應用的可行性，并探索應用過程中的關鍵步驟，為深入有效、穩定利用該技術創制棉花種質資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用材料為前期采用化學誘變劑處理獲得的后代材料，目前已經成為基本穩定的材料，共計4份材料，包括1份對照材料(用石引對照表示)，3份不同劑量誘變劑處理后的后代材料(分別用石引150、石引200、石引250表示)。

1.2 CELI酶的提取

CELI酶的提取采用蛋白質提取試劑盒進行，具體方法參照相應的說明書，如下：①在1 mL蛋白提取裂解液中加入適量蛋白酶抑制劑和PMSF(苯甲基磺酰氟)；②取100 mg新鮮芹菜嫩葉或莖稈組織放入研缽中，并在液氮環境中碾碎；③將碾碎后的芹菜嫩葉或莖稈組織，加入步驟1混合而成的裂解液中，在4 ℃溫度條件下裂解20～30 min；④在4 ℃溫度條件下，10 000 r/min，離心30 min，吸取上清液，即得CELI酶粗提液，提取物分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3 CELI酶的活性檢測

以標準酶SURVEYOR Mutation Detection Kit Components為對照，用提取的CELI酶對擴增的Control C和Control G異質雙鏈DNA分子進行酶切，比較提取的CELI酶粗提液與SURVEYOR酶的酶切效果，具體驗證步驟：①對SURVEYOR Mutation Detection Kit Components中的Control C和Control G(with primers)在最佳退火溫度下進行PCR擴增，20 μl PCR體系包括10×Taqbuffer 2 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，Control C/Control G(with primers)2 μl，E×Taq(5 U/μl)0.2 μl，DNA模板2 μl，ddH2O 12.8 μl。PCR擴增程序為95 ℃ 2 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，32個循環；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。②取4 μl PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保擴增產物單一且濃度適宜后進行異質雙鏈的合成，分別取Control C和Control G(with primers)的PCR擴增產物各10 μl，經過表1所示的PCR擴增程序，獲得堿基錯配的異質雙鏈DNA分子。③以SURVEYOR酶為對照，用本實施例提取的CELI酶粗提液對異質雙鏈產物進行酶切，酶切溫度45 ℃，酶切時間40 min，酶切體系為10 μl異質雙鏈DNA分子 + 8 μl ddH2O + 2 μl SURVEYOR/CELI酶粗提液。④酶切結束后，加入2 μl的6×loading Buffer在2 %的瓊脂糖凝膠電泳上進行酶切效果檢測，比較分析本實施例提取的CELI酶粗提液與SURVEYOR Mutation Detection Kit Components中SURVEYOR酶的酶切效果。

表1 堿基錯配異質雙鏈形成PCR擴增程序

1.4 基因組DNA的制備

從每份材料中隨機選取10份單株進行基因組DNA的提取，采用CTAB法進行提取，用核酸檢測儀進行DNA質量和濃度的檢測。

1.5 棉花纖維發育相關基因序列查找及引物設計

根據連續3年(2015-2017)的纖維測量數據發現4份材料在纖維長度上存在較明顯的差異，參照棉花纖維發育相關基因文獻選取了6個與纖維發育相關的基因序列進行引物設計，用于實驗驗證，具體序列如表2。

1.6 棉花纖維發育相關基因Eco-Tilling分析

將提取的對照和突變體材料基因組DNA進行稀釋，使濃度保持一致，然后進行基因PCR擴增，擴增體系為20 μl，包括10×PCR Buffer 2 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，引物各1 μl，E×Taq(5 U/μl)0.2 μl，DNA模板2 μl，ddH2O 12.8 μl。PCR擴增程序為95 ℃ 2 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s(根據各引物退火溫度進行設置)，72 ℃ 50 s，32個循環；72 ℃ 7 min；4 ℃保存 。

表2 纖維發育相關基因引物序列

PCR程序結束后，取5 μl產物進行瓊脂糖(濃度為2 %)電泳檢測，確定在對照和誘變材料上所得到的產物都為單一、特異性條帶；然后分別取對照和誘變材料PCR產物，按照等體積(各10 μl)進行混合，在PCR儀上進行PCR產物的雜交，形成錯配異質鏈，雜交程序為99 ℃ 2 min，99 ℃降至72 ℃ (-1 ℃/s)，72 ℃降至25 ℃(-0.3 ℃/s)，4 ℃保存。

將異質鏈采用提取的CELI酶進行酶切，酶切體系為：2 μl錯配異質鏈，2 μlCELI酶，8 μl ddH2O。酶切程序為45 ℃保持30～60 min，酶切產物采用4 %的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.7 棉花纖維發育相關基因測序驗證

將經過酶切后能夠產生酶切條帶的基因PCR產物進行載體連接、轉化、涂板和初步驗證后，連接正確菌液送測序公司測序，對照和誘變材料相應基因各送5個重復菌液。

1.8 測序數據分析

對從測序公司獲得的序列數據采用軟件DNAMAN進行比對，確定誘變材料與對照相應基因序列之間的差異堿基類型及位置，與前期酶切結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 芹菜CELI酶的提取及其活性驗證

由圖1可以看出，采用蛋白質提取試劑盒能夠從芹菜的不同組織中獲得與預期大小一致的CELI條帶，并且從嫩葉中提取的酶較莖中提取的效果好，為后期的實驗開展提供了借鑒。通過與購買的試劑盒內標準的CELI酶類進行酶切效果及活性實驗對比，發現從芹菜中提取的CELI酶同樣能夠達到預期的酶切效果(圖2)，說明提取的CELI能夠替代試劑盒中的類似酶，用于后期的試驗降低了實驗成本。

圖1 CELI酶提取的SDS-PAGE考馬斯亮藍染色圖Fig.1 SDS-PAGE ofCELI enzyme

2.2 棉花纖維發育相關基因Eco-Tilling分析結果

從酶切電泳圖和測序結果分析得到，在選取設計的6個與棉花纖維發育相關的基因中，其中4對引物能夠擴增得到單一、特異性的條帶(圖3A)，4對引物中最終只有2對引物擴增基因在材料間存在著SNP差異(圖3B)，分析測序結果證明引物L-D-1F/1R擴增基因在材料間存在著SNP差異，比對結果顯示該基因為纖維相關基因Gh14-3-3L，其中擴增產物在石引150與對照材料存在1個SNP位點差異，位于320 bp處(插入1個堿基T)，測序驗證得到2條條帶(分別為320和453 bp)；石引200與對照材料存在2個SNP位點，分別位于320和380 bp處(320 bp處插入1個堿基T，380 bp處堿基T變為G)，測序驗證得到3條條帶(分別為320、60和393 bp)；石引250與對照存在1個SNP位點，位于320 bp處(插入1個堿基T)，測序驗證得到2條條帶(分別為320和453 bp，圖4)。

圖2 CELI與試劑盒Surveyor酶活性對比檢測圖Fig.2 The compairson chart ofCELI activity and surveyor kit

A.對照與誘變材料差異基因擴增圖示；B.對照與誘變材料CELI酶酶切圖示A. The figure of amplification; B. The figure of enzymatic圖3 對照與誘變材料差異基因擴增及CELI酶酶切圖示Fig.3 The figure of differential gene amplification andCELI enzymatic between control and mutant materials

L-1：對照材料；L-2：石引150材料；L-3：石引200材料；L-4：石引250材料L-1: Control;L-2:Shiyin150;L-3:Shiyin200;L-4:Shiyin 250圖4 誘變材料與對照材料Gh14-3-3L基因核苷酸序列差異Fig.4 The nucleotide sequence compairson ofGh14-3-3Lbetween control and mutant materials

2.3 棉花纖維相關基因Gh14-3-3突變SNP位點結構分析

對Gh14-3-3進行結構分析發現，誘變獲得的3份材料均在320 bp處存在1個SNP位點的改變，編碼的氨基酸由半胱氨酸(C)變為亮氨酸(L)，使該基因的開放閱讀框發生了改變(提前終止)，由編碼132個氨基酸變為104個氨基酸，從而導致蛋白結構的改變(圖5)。 對比對照和誘變材料Gh14-3-3L基因氨基酸與保守序列發現，開放閱讀框內有1個氨基酸發生，使開放閱讀框提前終止，從而改變了基因的保守序列的長短(圖6)誘變材料的保守序列相對于對照材料縮短，使蛋白結構也發生了改變。

2.4 棉花纖維相關基因Gh14-3-3保守區域及結構分析

由三級結構分析可以看出，突變前后的蛋白均屬于Gh14-3-3蛋白家族，突變前的蛋白結構屬于該家族典型的結構，具有9個α-螺旋，而突變后的蛋白結構由于編碼框長度的改變，最終變為8個α-螺旋。對照與誘變材料Gh14-3-3蛋白在親水與疏水性方面的差異不明顯，屬于疏水性蛋白(圖8)。

L-1：對照材料；L-2：石引150材料；L-3：石引200材料；L-4：石引250材料L-1: Control;L-2:Shiyin150;L-3:Shiyin200;L-4:Shiyin 250圖5 誘變與對照材料Gh14-3-3L基因氨基酸序列差異Fig.5 The amino acid sequence compairson of Gh14-3-3L between control and mutant materials

A.誘變材料Gh14-3-3基因保守區域； B. 對照材料Gh14-3-3基因保守區域A.Mutant materials; B. Control圖6 誘變與對照材料Gh14-3-3L基因保守區域分析差異Fig.6 TheGhI4-3-3Lgene conservative region comparison of mutagenic and control material

A.對照材料Gh14-3-3基因蛋白；B～C. 誘變材料Gh14-3-3基因蛋白A.Control； B-C.Mutant material圖7 對照材料和誘變材料Gh14-3-3L蛋白三級結構預測Fig.7 The tertiary structure comparison of Gh14-3-3L protein between control and mutagenic material

2.5 對照與誘變材料纖維數據比較

連續3年(2015-2017)測定對照與誘變材料的纖維長度數據，發現石引200絨長數據分析與對照存在差異性，石引150和石引250絨長數據與對照沒差異性，數據結果與SNP位點和測序數據存在一致性，推斷可能與石引200材料SNP位點數較其它兩個材料多1個有關，具體關聯性待進一步驗證。

3 討 論

傳統的育種手段與現代生物育種技術相比仍比較原始和落后，使育種水平的提高受到很大限制，同時，由于受到棉花品種內在和外在條件的限制，育種周期較長，制約了培育新品種的速度。因此，如何加快棉花的育種速度，是多少年來育種家一直渴望解決的問題，也是當前擺脫育種困境的關鍵，擬南芥TILLING[17]計劃的成功實施，帶動了多種作物TILLING 檢測服務系統，這些專項 TILLING 計劃，通過建立標準化的 TILLING技術平臺，共享突變體網絡數據庫資源，提高了突變檢測效率，降低成本，可以有效地服務于科研及企事業單位，提高TILLING 技術應用效率。隨著越來越多物種基因組序列的破譯，將會進一步擴大 TILLING 技術的物種檢測范圍及其更多的目標基因，這為TILLING 技術的廣泛應用奠定了基礎[5-6,8,17]。本文通過探索TILLING 技術在新疆早熟陸地棉種質創新過程中的關鍵問題，構建可靠的TILLING 技術體系，同時借助于這種技術篩選出一些在抗逆與品質性狀方面具有利用價值的新種質，為相應的栽培品種選育及研究提供新的種質，拓展新疆棉花種質的遺傳基礎。

A.Gh14-3-3蛋白親水性圖示；B.Gh14-3-3蛋白疏水性圖示A. The hydrophilicity of Gh14-3-3L;B. The Hydrophobicity of Gh14-3-3L圖8 對照材料和誘變材料Gh14-3-3L蛋白親疏水性Fig.8 The hydrophilicity and hydrophobicity comparison of Gh14-3-3L gene protein between control and mutant material

圖9 對照材料和誘變材料纖維數據差異顯著性分析Fig.9 The significant difference analysis of fiber data between control and mutagenic material

4 結 論

通過對前期獲得誘變材料進行表型性狀與分子水平的驗證，發現采用獲得的誘變體系和鑒定技術創制棉花種質具有可行性，所得材料在表型性狀及分子水平方面都發生了變異，并且變異位點與表型性狀的變異具有關聯性，研究結果能夠為深入研究TILLING技術在棉花及其它植物種質資源創制方面提供理論依據和技術。