金錢草組織培養及其快速繁殖研究

楊冬業 張麗珍 韋雅芳

摘要[目的]建立金錢草莖段組織培養再生體系。[方法]于4、5月取當年生金錢草莖段為外植體，MS作為基礎培養基，研究不同植物生長調節劑對誘導、增殖、生根過程的影響。[結果]MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.20～0.50mg/L適合金錢草不定芽誘導，誘導率為100%;MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.10～0.20mg/L適合繼代增殖培養;1/2MS+IBA0.50mg/L+NAA0.1～0.5mg/L適合不定根誘導，誘導率高達100%;組培苗移植到盛有腐殖質花盆中，成活率為100%。[結論]該研究可為金錢草野生種質資源保存和優質種苗生產提供技術參考。

關鍵詞金錢草;組織培養;再生

中圖分類號S503.53文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0090-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.028

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

金錢草（LysimachiachristinaeHance.）為報春花科珍珠菜屬植物，分布于云南、廣西、四川、貴州、河南、湖北、湖南、江蘇、陜西、江西、安徽、浙江等地。金錢草味苦、酸、微寒，歸肝、膽、腎、膀胱經。清熱解毒，利尿排石，活血化瘀，用于治療肝、膽結石，膽囊炎，黃疸型肝炎，泌尿系結石，水腫，跌打損傷，毒蛇咬傷及藥物中毒[1-3]。近年來，國內學者對金錢草在利膽排石方面進行了大量臨床應用。對金錢草在排石、利膽利肝、抗炎、抗氧化等多方面的藥理作用進行全面分析，發現金錢草對腎結石和膽結石都有防治作用，對治療肝膽系統的炎癥更顯優勢[4-6]。傳統上金錢草繁殖以分株繁殖和種子繁殖為主，亦可扦插繁殖。近年來由于過度的采摘利用，金錢草野生資源幾乎枯竭，目前金錢草雖然可以采用種子或扦插進行人工繁殖栽培，但繁殖率低且苗勢退化現象嚴重。植物組織培養是指以離體植物器官、組織、細胞或原生質體，在一定條件下進行培養，并誘導其增殖、分化，建立無性繁殖體系，或獲取人類所需要的植物細胞產物的技術過程。應用植物組織培養快繁技術擴大繁殖金錢草是一條較好的解決途徑。采用組織培養快繁技術，可以保持金錢草品種優勢，避免由于種子繁殖引起雜種分離，并有助于對金錢草抗真菌、抗細菌、抗蟲等基因工程研究的順利進行。筆者利用植物組織培養技術，建立金錢草無性繁殖體系，以期為金錢草人工選育及工廠化育苗提供技術參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗于2016年3月—2018年6月在桂林師范高等專科學校分子生物學實驗室進行。金錢草由廣西植物研究所提供，取4、5月金錢草新生枝條為材料進行試驗。

1.2方法

1.2.1

不定芽誘導培養。截取粗壯、生長良好的金錢草植株，剪去帶柄葉片，用洗潔精清洗腋芽和莖干，自來水沖洗清洗液的泡沫，再用自來水流動沖洗2h。在無菌超凈臺上，將金錢草莖干剪成帶有莖節小段，置于無菌三角瓶中，0.1%升汞消毒10min，無菌蒸餾水清洗2～3次，接種到金錢草不定芽誘導培養基中，培養基中均添加3%蔗糖和0.8%瓊脂。置于（25±1）℃的培養室中培養，光照12h/d，光照強度為1000～1500lx，觀察并記錄其生長情況，分化率=發芽外植體數/接種數×100%。

1.2.2

繼代增殖培養。當金錢草側芽長至2～3cm時，可轉接到繼代培養基中進行擴大增殖培養，置于（25±1）℃的培養室中培養，光照12h/d，光照強度為1000～1500lx，定期觀察并記錄生長情況。

1.2.3

生根培養。取生長良好、莖節間均勻、高度3～4cm的苗進行生根培養。截取生長良好的組培苗2～3cm，轉接到附加有不同濃度IBA的1/2MS誘導生根培養基中，置于（25±1）℃的培養室中培養，光照12h/d，光照強度為1000～1500lx，觀察并記錄其生長情況。

1.2.4

移栽。當組培苗植株不定根長至3～5cm時，打開瓶塞，煉苗2～3d，再移植到盛有腐殖質的花盆中，前3d進行遮陰，注意保濕，觀察統計組培苗生長情況及成活率。

2結果與分析

2.1金錢草不定芽誘導培養

以金錢草嫩莖段為外植體誘導不定芽發生，建立金錢草高效繁殖再生體系。將金錢草外植體接種到MS誘導培養基后，第8天觀察到個別外植體莖節處出現不定芽，20d后觀察到不定芽長至1cm左右（圖1），30d后觀察統計結果。

從表1可以看出，不同濃度的細胞分裂素和生長素配比對金錢草外植體不定芽誘導的影響是不同的。低濃度細胞分裂素和生長素可誘導少數不定芽，而且不定芽生長較快，誘導率較高;高濃度細胞分裂素和生長素可誘導較多不定芽，但容易出現愈傷組織，濃度越高愈傷組織越多。對照組沒有不定芽產生，說明植物生長調節劑對金錢草莖段不定芽誘導是必需的。綜上所述，金錢草莖段最佳誘導培養基為MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.20～0.50mg/L，在此條件下能誘導出較多不定芽，且均為有效芽，莖干粗壯，莖節間距適中，葉片伸展翠綠，適合繼代增殖培養。

2.2金錢草繼代培養

當金錢草側芽長至2～3cm時，可轉接到繼代培養基中進行擴大增殖培養，20d后觀察統計結果。

由表2可知，當培養基為MS+6-BA0.2～0.5mg/L+IBA0.02～0.05mg/L時，不定芽粗壯，高達3～4cm，葉片較大伸展，呈嫩綠色，適合用于生根培養（圖2）;當培養基為MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.10～0.20mg/L時，增殖系數較高，有效不定芽為5～10個，適合用于增殖培養。

2.3金錢草生根培養

取生長良好、莖節間均勻、高度3～4cm的苗進行生根培養，10d左右出現不定根，20d觀察統計結果。

由表3可知，金錢草不定根容易誘導，低濃度生長素可誘導出不定根，而且生長良好（圖3）。當向1/2MS培養基中添加0.50mg/LIBA+0.1～0.5mg/LNAA組合生長素時，生根率高達100%，組培苗根系旺盛，有氣生根，多根毛，葉子深綠，植株健壯，適合移栽。

2.4移栽

當組培苗植株不定根長至3～5cm時，打開瓶塞，煉苗2～3d，再移植到盛有腐殖質花盆中，移栽20d，成活率達100%（圖4）。

3討論

3.1外植體滅菌劑的選擇

取自自然界中的外植體，一般

帶有多種生長迅速的微生物，其在營養豐富的培養基中會大量繁殖，使得培養基被感染，從而抑制培養物生長。因此初代培養前必須對外植體進行嚴格的滅菌處理。滅菌劑的選擇和處理時間的長短取決于外植體對試劑的敏感性。對滅菌劑敏感的外植體，一般選用易分解的次氯酸鈉，滅菌時間不宜過長;而對滅菌劑不敏感的，一般選用毒性較強的升汞消毒，且滅菌時間適當延長。升汞溶液幾乎可以殺死自然界中大部分微生物，是所有滅菌劑中滅菌效果最好的。但是用升汞溶液滅菌也有缺點，就是溶液濃度過高或者滅菌時間過長會毒死幼嫩的外植體，濃度過低或滅菌時間短又不能殺死外植體表面的微生物，使得試驗過程中培養基受到污染而發霉長菌。該試驗選用0.1%升汞溶液作為金錢草滅菌劑，滅

菌時間為10min。此處理方式，雖然也有極個別金錢草莖段被殺死和感染，但是絕大多數的金錢草莖段都未被污染，達到了很好的滅菌效果。

3.2外植體的增殖及繼代培養

外植體進行無菌接種后，隨之而來的是外植體不定芽的誘導和生長分化。從外植體分化產生的叢生芽、不定芽數量少，達不到直接生產生根苗的階段，必須進一步培養增殖，才能達到快速繁殖的目的。在適宜培養基和適宜培養條件下，培養物或外植體能按幾何倍數增殖[7]。進行多次增殖培養試驗發現，最初2次增殖培養，金錢草植株生長速度較快，一般在20～25d就可以長至5cm左右，植株粗壯、伸展、葉片翠綠，但增殖系數較低。隨后繼代增殖培養時，金錢草的生長速度比較慢，60d才長至5cm，但增殖系數較高。

3.3不同植物生長調節劑對植物組織培養的影響

在進行金錢草不定芽誘導培養、繼代增殖培養及不定根誘導培養時，一般使用6-BA、NAA及IBA等植物生長調節劑。適宜濃度的細胞分裂素與生長素配比有利于不定芽的形成及生長[8]。但若細胞分裂素的濃度過高，會形成過多的不定芽，

從而使不定芽的長勢受到抑制，結果使植株過于纖細、密集，小苗不能生長，很難獲得健壯組培苗;若細胞分裂素的濃度過低，繁殖系數降低，利于植株生長。在金錢草不定芽誘導培養、繼代增殖培養及不定根誘導培養時，植物生長調節劑種類及濃度都在不斷地變換，從而使金錢草莖能夠快速增殖生長。在培養過程中發現，當添加相同濃度的IBA和6-BA時，主要誘導出金錢草不定根，抑制不定芽生長。IBA濃度過高時，組培苗的葉片縮皺而卷曲，不利于植株生長。

參考文獻

[1]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編[M].北京：人民衛生出版社，1986：538.

[2]江蘇新醫學院.中藥大詞典（上冊）[M].上海：上海科學技術出版社，1997：150-151.

[3]中國科學院西北植物研究所.秦嶺植物志：第1卷第4冊[M].北京：科學出版社，1983：29-54.

[4]李靜，胡國全，桂敬強，等.金錢草水提液對小鼠腎臟草酸鈣結石形成的干預作用[J].安徽科技學院學報，2014，28（2）：5-11.

[5]李惠芝，姚崇舜，陳濟民，等.廣金錢草粗提物中多糖的含量測定[J].沈陽藥科大學學報，1995，12（1）：21-24.

[6]李靜，賀紹君，劉德義.金錢草防治泌尿系統結石機理研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2015，17（3）：79-81.

[7]余伯陽.中藥生物技術[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005：195-196.

[8]梁定仁，黃明勛，林偉，等.植物生長調節劑對廣金錢草扦插繁殖效果的影響[J].南方農業學報，2016，47（4）：614-617.