缺血再灌注對小鼠蛻膜化子宮內(nèi)膜的作用

陳西華，曹惠子，關(guān)碩，陸超，賀斌，徐祥波*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 110191)

月經(jīng)是女性重要的生理現(xiàn)象。未妊娠的情況下，子宮內(nèi)膜在雌/孕激素的作用下周期性的發(fā)生剝脫，并以出血的方式排出體外。月經(jīng)異常是婦科疾病常見的癥狀，包括月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、月經(jīng)過多、痛經(jīng)、產(chǎn)后腹痛、惡露不盡等。正常的月經(jīng)周期對女性的生殖健康與生活質(zhì)量具有重要意義。

早在1940年，Markee[1]就利用恒河猴對月經(jīng)現(xiàn)象進(jìn)行研究，將人子宮內(nèi)膜外植體移植到恒河猴的眼前房中，觀察到月經(jīng)發(fā)生前，蛻膜化子宮內(nèi)膜中螺旋動脈有節(jié)律的舒張和收縮；螺旋動脈劇烈痙攣大約24 h后，子宮內(nèi)膜組織崩解并伴隨出血現(xiàn)象。由此推測，月經(jīng)是由于子宮內(nèi)膜螺旋動脈收縮、內(nèi)膜發(fā)生缺血再灌注，此過程造成組織呈缺血缺氧，直接導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞壞死與崩解出血。以上是月經(jīng)發(fā)生的經(jīng)典理論假說。但是，關(guān)于缺氧再灌注是否存在、低氧是否直接導(dǎo)致子宮內(nèi)膜崩解等關(guān)鍵問題，近年不同研究組得出了相互矛盾的結(jié)論。1997年，Gannon等[2]利用多普勒超聲技術(shù)對人類子宮內(nèi)膜在月經(jīng)過程中的微血管紅細(xì)胞流速的變化進(jìn)行研究，結(jié)果未檢測到月經(jīng)前子宮內(nèi)膜的缺血再灌注過程。2002年Zhang等[3]發(fā)現(xiàn)，作為低氧的重要反應(yīng)因子HIF1A與HIF2A僅在少部分人圍月經(jīng)期子宮內(nèi)膜標(biāo)本的基質(zhì)細(xì)胞中存在，且發(fā)現(xiàn)在低氧培養(yǎng)條件下，與子宮內(nèi)膜崩解緊密相關(guān)的金屬基質(zhì)蛋白酶proMMP-1、proMMP-3和MT1-MMP的表達(dá)以及MMP-2的活性受到抑制。而在我們的前期研究中，利用低氧探針確認(rèn)了小鼠月經(jīng)樣模型中孕酮撤退后子宮內(nèi)膜存在低氧[4]。

本研究以小鼠月經(jīng)樣模型為基礎(chǔ)，利用血管夾持手術(shù)的方法，研究缺血再灌注與月經(jīng)發(fā)生的關(guān)系。

材料和方法

一、研究對象

1.實驗動物：SPFII級雄性與雌性13周齡NIH小鼠(國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所實驗動物中心提供)。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物飼養(yǎng)，光照6：00～18：00，溫度(21±1℃)。所有的實驗步驟均獲得國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。

2.藥品與試劑：花生油(魯花牌5S一級壓榨)、多聚甲醛(國藥集團(tuán))、組織包埋用石蠟(Leica，德國)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑(北京中杉金橋)。

二、研究方法

1.小鼠模型的建立：將雌鼠與輸精管結(jié)扎雄鼠進(jìn)行交配，次日中午12：00見栓記為0.5 d；3.5 d，在小鼠子宮腔內(nèi)注射15 μl花生油，以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜發(fā)生蛻膜化；5.5 d蛻膜化誘導(dǎo)完成[5-6](圖1)。

圖1 小鼠模型的建立方法與實驗流程示意圖

2.分組處理：模型小鼠隨機(jī)分為3組：對照組(n=8)、假手術(shù)組(n=8)與缺血再灌注組(n=10)。對照組的小鼠不作任何處理；假手術(shù)組的小鼠進(jìn)行開腹手術(shù)但不進(jìn)行子宮缺血再灌注手術(shù)；缺血再灌注組子宮實行缺血再灌注手術(shù)。

小鼠蛻膜化子宮缺血再灌注手術(shù)方法：小鼠腹腔開口，將右側(cè)子宮角上下兩端的主血管用止血夾夾住。血管夾持前蛻膜化的子宮呈粉紅色，血管夾持后1 min內(nèi)變?yōu)榘导t色(圖2)。確定血管夾好后開始計時，30 min后小心取下止血夾。止血夾取下后，子宮在1 min之內(nèi)由暗紅色恢復(fù)為最初的粉紅色。隨后，將器官復(fù)位并仔細(xì)縫合。左側(cè)子宮角不做子宮缺血再灌注手術(shù)。手術(shù)完成時間記為處理后0 h。在處理后6 h與24 h小鼠處死取材。期間觀察小鼠陰道出血情況并記錄。

3.小鼠子宮大體形態(tài)與組織形態(tài)學(xué)觀察：小鼠子宮取材后，對子宮大體進(jìn)行拍照。隨后子宮立即用4%多聚甲醛固定約24 h。固定好的小鼠子宮制成常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色并觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

A：缺血再灌注手術(shù)示意圖：用止血夾夾持子宮上、下兩端的主血管；B：小鼠用止血夾；C、D：血管夾持前、后小鼠子宮。黃色箭頭指示子宮圖2 小鼠蛻膜化子宮缺血再灌注手術(shù)操作

結(jié) 果

一、陰道出血觀察

缺血再灌注組手術(shù)完成時間記為處理后0 h，并適用于其他處理組。處理后0～24 h，對照組模型小鼠未觀察到陰道出血現(xiàn)象，假手術(shù)組絕大多數(shù)模型小鼠也未見出血；缺血再灌注組，少數(shù)小鼠(2/10)在處理后8 h時觀察到陰道出血現(xiàn)象，處理后12 h約一半的小鼠(6/10)出現(xiàn)陰道出血現(xiàn)象，處理后24 h大多數(shù)小鼠(8/10)觀察到了陰道出血現(xiàn)象(表1)。

表1 各分組中陰道出血的小鼠數(shù)量與處理后24 h子宮內(nèi)膜崩解的小鼠數(shù)量統(tǒng)計 [n(%)]

二、小鼠子宮內(nèi)膜崩解數(shù)量統(tǒng)計

對各分組小鼠在處理后24 h子宮內(nèi)膜崩解的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。對照組小鼠均未發(fā)生崩解出血；假手術(shù)組僅1例小鼠的子宮發(fā)生崩解出血；缺血再灌注組，絕大多數(shù)小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)生了完全崩解。該組中發(fā)生崩解的小鼠，其子宮角夾持側(cè)與未夾持側(cè)均發(fā)生了相同程度的崩解(表1)。

三、大體形態(tài)與組織形態(tài)學(xué)觀察

處理后24 h小鼠全部處死取材。此時，所有對照組與絕大部分假手術(shù)組的小鼠子宮呈淡紅色，缺血再灌注組絕大部分小鼠子宮呈暗紅色(圖3)。

將取材子宮制作常規(guī)石蠟切片并HE染色，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。對照組與假手術(shù)組小鼠的子宮內(nèi)膜完好，蛻膜化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核增大，子宮腔上皮完好，未觀察到組織內(nèi)大量紅細(xì)胞滲出現(xiàn)象。缺血再灌注組小鼠的蛻膜化細(xì)胞邊界消失，細(xì)胞核固縮，子宮腔上皮消失，組織裸露與空腔內(nèi)，觀察到大量紅細(xì)胞滲出現(xiàn)象，此為子宮內(nèi)膜崩解出血現(xiàn)象(圖3)。

進(jìn)一步觀察分析小鼠模型缺血再灌注組，血管夾持側(cè)與未夾持側(cè)子宮形態(tài)的變化。在處理后6 h，血管未夾持側(cè)的子宮內(nèi)膜完好，未觀察到明顯的血管擴(kuò)張或蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞崩解現(xiàn)象。而相比之下，血管夾持側(cè)的子宮內(nèi)膜在子宮系膜對側(cè)靠近子宮腔上皮下方區(qū)域，出現(xiàn)明顯的血管擴(kuò)張現(xiàn)象，大量紅細(xì)胞滲出進(jìn)入基質(zhì)細(xì)胞。而該區(qū)域的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了早期的崩解壞死現(xiàn)象。到了處理后24 h，無論夾持側(cè)或未夾持側(cè)，絕大部分小鼠的子宮內(nèi)膜均觀察到完全崩解的現(xiàn)象，崩解程度沒有顯著差異。而假手術(shù)組在處理后6 h與24 h均未觀察到明顯的紅細(xì)胞滲出現(xiàn)象(圖4)。

A、B：對照組；C、D：假手術(shù)組；E、F：缺血再灌注組圖3 小鼠月經(jīng)樣模型處理后24 h大體形態(tài)與組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色 ×200)

A～F：缺血再灌注組，其中A～C示血管未夾持側(cè)，D～F示血管夾持側(cè)，A、B、D、E示缺血再灌注后6 h，C、F示缺血再灌注后24 h；G～I(xiàn)：假手術(shù)組，其中G、H示假手術(shù)后6 h，I示假手術(shù)后24 h圖4 小鼠模型缺血再灌注組與假手術(shù)組在處理后6 h與24 h子宮組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色 ×200)

討 論

月經(jīng)發(fā)生的經(jīng)典理論假說認(rèn)為，子宮內(nèi)膜螺旋動脈缺血缺氧，引發(fā)了子宮內(nèi)膜的崩解[1]。但是近幾年，缺氧在月經(jīng)發(fā)生中的作用存在不少爭議，不同研究組在體內(nèi)、體外或在體模型的研究結(jié)果得出相反的結(jié)論[2-4，7-9]。

本研究采用了小鼠月經(jīng)樣模型對缺血再灌注在月經(jīng)發(fā)生中的作用進(jìn)行研究。在最早的小鼠月經(jīng)樣模型中，已明確月經(jīng)發(fā)生需要三個不可或缺的基本要素：(1)必要的激素準(zhǔn)備；(2)子宮內(nèi)膜發(fā)生蛻膜化；(3)蛻膜化后的孕酮撤退[10-11]。本研究將蛻膜化的小鼠子宮，利用手術(shù)方法引發(fā)小鼠單側(cè)子宮角缺血再灌注，進(jìn)而觀察子宮內(nèi)膜發(fā)生的變化。結(jié)果顯示，在缺血再灌注后6 h，子宮腔上皮下方區(qū)域的組織形態(tài)已發(fā)生顯著變化，血管擴(kuò)張、紅細(xì)胞滲出，該區(qū)域的子宮內(nèi)膜已開始發(fā)生崩解出血現(xiàn)象；在小鼠子宮缺血再灌注24 h后，子宮內(nèi)膜發(fā)生了完全的崩解出血現(xiàn)象。而對照組中，沒有小鼠發(fā)生子宮內(nèi)膜的崩解出血，假手術(shù)組僅1只小鼠發(fā)生崩解出血現(xiàn)象?？梢源_定，缺血再灌注在沒有孕酮撤退的情況下，即可引發(fā)子宮內(nèi)膜崩解。另一方面，缺血再灌注手術(shù)僅在模型小鼠的一側(cè)子宮角實施，但在處理后24 h發(fā)生崩解出血的小鼠的雙側(cè)子宮角均發(fā)生了完全的崩解，表明缺血再灌注雖然是子宮內(nèi)膜崩解出血的始動因素，但并不是導(dǎo)致最終崩解的直接原因。僅開腹假手術(shù)也能夠在一定程度上引發(fā)子宮內(nèi)膜崩解。由此推測，缺血再灌注可能啟動了某種信號，使子宮內(nèi)膜在不依賴孕酮撤退的條件下誘發(fā)了子宮內(nèi)膜崩解。

缺血再灌注手術(shù)和假手術(shù)，對于小鼠子宮及小鼠機(jī)體均會造成強(qiáng)烈的刺激，強(qiáng)烈的刺激下會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。較早前研究中已知，應(yīng)激反應(yīng)能夠干擾子宮正常的生殖生理現(xiàn)象，例如閉經(jīng)、不孕、子宮內(nèi)膜容受性異常等，甚至引發(fā)早產(chǎn)或流產(chǎn)[12]。以往的研究結(jié)果提示，應(yīng)激反應(yīng)可能是造成月經(jīng)失調(diào)的主要因素[13-15]。此外，某些環(huán)境因素與下丘腦閉經(jīng)現(xiàn)象存在一定聯(lián)系[16]。較早前，對393名女性學(xué)生的研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)激能夠引發(fā)經(jīng)前綜合征、月經(jīng)過少、閉經(jīng)與月經(jīng)過多[17]。因此，缺血再灌注引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)可能在子宮內(nèi)膜崩解的信號通路中起重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果明確了缺血再灌注能夠?qū)е伦訉m內(nèi)膜崩解，而缺血再灌注引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)可能在月經(jīng)發(fā)生中扮演了重要的角色。但其中的分子機(jī)制仍需要更多深入研究進(jìn)一步闡明。