血清miRNA-130a與HBV相關慢加急性(亞急性)肝衰竭患者預后的相關性分析

薛揚 郭宏強

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是以凝血機制障礙、高膽紅素血癥、黃疸、腹水、肝性腦病、肝腎綜合征以及多臟器功能衰竭等為主要表現的臨床癥候群[1]。我國90%的ACLF由乙型肝炎病毒(HBV)引發，稱為乙型肝炎病毒相關慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)。ACHBLF病死率高，病情兇險，進展迅速，患者普遍預后差[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)能調控轉錄水平后的基因翻譯[3]，其機制為結合信使RNA的3'端非翻譯區進行調控，此外胚胎的發育、細胞增殖與分化均與miRNA關系密切。miR-130a在急性心肌炎、類風濕關節炎、腎炎中表達增加，提示miR-130a在炎癥反應中發揮重要調控作用。但目前尚無關于miRNA-130a與ACHBLF預后關系的研究報道。因此本研究擬分析血清miR-130a水平與ACHBLF患者預后的相關性，為ACHBLF的早期診斷、臨床治療以及預后效果分析提供理論及實踐依據。

資料和方法

一、一般資料

收集2013年7月至2017年6月本院收治ACHBLF患者110例，所有患者行血常規、血生化、尿常規、血清乙型肝炎兩對半(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)、血清HBV DNA等常規檢查，符合我國2012年《肝衰竭診治指南》中的診斷標準[4]。 ACHBLF患者按照死亡結局分成生存組54例、死亡組56例，兩組在性別、年齡、病程等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，同時匹配本院體檢中心健康體檢者52名作為對照組。患者及家屬簽訂知情同意書、通過醫院倫理委員會審核。

納入標準：可自由交流和溝通；聚合酶鏈式反應(PCR)檢測血HBV DNA載量升高且肝功能異常；極度乏力，并有明顯厭食、嘔吐和腹脹等嚴重消化道癥狀；腹部肝膽B超及磁共振胰膽管造影排除先天性代謝性疾病、膽道閉鎖及其他原因所致的肝炎；未出現肝性腦病或明顯腹水；ALT持續或反復異常，或肝組織學檢查有肝炎病變。

排除標準：人類免疫缺陷病毒感染者、丁型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、膽汁淤積性肝病、自身免疫性肝病患者、各種急慢性感染的患者，以及惡性腫瘤患者；其他病因引起的免疫復合物腎炎。

二、研究方法

(一)主要儀器及試劑

Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術公司產品)、miRNA-130a基因的表達測定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)、實時熒光定量PCR儀(美國熱電公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)、超凈工作臺(上海恒躍醫療器械有限公司)。

(二)血清miRNA-130a mRNA表達水平測定

患者清晨空腹靜脈抽血10 ml，置于普通無菌采血管中，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，用于測定miRNA-130a mRNA表達水平。參照GenBank 數據獲取 2 個基因多態性位點的序列，設計待測基因位點的PCR 擴增引物和單堿基延伸引物，按20 μL模板和 50 μL反應液構成 PCR反應體系， 擴增程序: 96 ℃ 6 min， 94 ℃ 15 s，65 ℃ 45 s，重復 60個循環，采集熒光。實時熒光定量 PCR儀檢測其表達量。

三、 統計學方法

結 果

一、三組一般情況比較

生存組、死亡組在性別、年齡、病程、Alb、ALT、AST、HBV DNA、TBil等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)；生存組、死亡組ALT、AST、TBil水平高于對照組，Alb水平低于對照組(P<0.05)。

二、對照組、ACHBLF組miRNA-130a mRNA表達水平比較

ACHBLF組miRNA-130a mRNA表達水平明顯高于對照組(1.98±0.68對0.67±0.14)(t=19.357，P<0.05)。

三、生存組、死亡組miRNA-130a、MELD評分、PT、PTA、APTT、INR比較

生存組miRNA-130a表達水平、APTT高于死亡組，MELD評分、PT、PTA、INR低于死亡組(t=12.127、10.712、14.413、8.241、9.387、13.298，P<0.05)。

表1 生存組、死亡組miRNA-130a、MELD評分、PT、PTA、APTT、INR比較

注：與生存組比較，bP<0.05

四、miRNA-130a與MELD評分、PT、PTA、APTT、INR相關性分析

miRNA-130a與MELD評分、PT、PTA、INR負相關明顯，與APTT正相關明顯(R=-0.654、-0.597、-0.593、-0.654、0.699，P<0.01)。

五、 mi RNA-130a、MELD評分對ACHBLF患者預后評估的診斷價值

受試者工作特征曲線提示，miRNA-130a ROC曲線下面積(AUC)為0.839(95%CI0.765～0.985)，MELD評分ROC曲線下面積(AUC)為0.777(95%CI0.587～0.903)，兩者AUC相近(P>0.05), miRNA-130a、MELD評分對ACHBLF患者預后評估的靈敏度、特異度相近(0.802對0.857, 0.746對0.789),(χ2=2.134、1.987，P>0.05)。

討 論

ACLF是在慢性肝病的基礎上，短期內出現肝功能失代償為主要表現的一組臨床癥狀癥候群[5]。我國90%的ACLF由HBV引發，稱為ACHBLF。目前ACHBLF發病機制尚不明確，普遍認為與免疫損傷，缺血缺氧和內毒素血癥相關。ACHBLF死亡率高達60%～80%，病情兇險，進展迅速，普遍預后差，嚴重威脅患者的健康。

研究發現外源性感染能引起miR-130a高表達，高度表達miR-130a蛋白的淋巴細胞株增殖能力明顯高于野生株[6]。本研究中，ACHBLF組miRNA-130a mRNA表達水平明顯高于對照，說明ACHBLF患者肝細胞受損，miR-130a mRNA大量釋放入血，而生存組miRNA-130a mRNA表達水平明顯高于死亡組，提示miRNA-130a具有促進ACHBLF患者良好預后的作用。 IL-8、血管內皮生長因子 (VEGF)可能由miR-130a調控，高表達miR-130a蛋白的淋巴細胞可分泌更多的IL-8、VEGF，而VEGF、IL-8在炎癥的形成過程中發揮重要作用[7-9]。綜上所述，ACHBLF患者血清miRNA-130a 表達水平上升，高水平表達的miRNA-130a能促進ACHBLF患者良好預后，其機制與miRNA-130a誘導免疫細胞因子產生有關。

本研究同時也發現，miRNA-130a與MELD評分、PT、PTA、INR負相關明顯，與APTT正相關明顯；而miRNA-130a、MELD評分ROC曲線下面積相近, miRNA-130a、MELD評分對ACHBLF患者預后評估的靈敏度、特異度相近；說明miRNA-130a具有較高的靈敏度、特異度，可作為判定ACHBLF患者預后的生物學標志物，值得在臨床上推廣應用。