miR-132、GPC3在乙肝相關肝癌患者中的表達及意義

楊啟 呂新遠 王哲

肝癌是較常見的惡性腫瘤之一，約80%肝癌患者合并乙型肝炎和肝硬化。有研究顯示[1-2]，約70%～80%乙肝相關肝癌患者確診時已為中晚期，其5年生存率極低，約為20%。早期評估乙肝相關肝癌病情及預后并采取針對性治療是提高其生存率的關鍵所在。近年來，雖然用于乙肝相關肝癌診斷的腫瘤標志物有所增多，但尚無一種公認度、敏感度和特異性均較高的可用于評價其病情、療效及預后的腫瘤標志物。多項腫瘤標志物聯(lián)合檢測將成為乙肝相關肝癌病情評估和預后判斷的趨勢。本研究分析乙肝相關肝癌患者血清微RNA-132(miR-132)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)水平，評估其在乙肝相關肝癌患者病情、療效和預后評估中的價值，以期為乙肝相關肝癌的治療提供參考。

資料和方法

一、 一般資料

前瞻性選取2015年2月至2017年2月我院就診的53例乙肝相關肝癌患者(乙肝相關肝癌組)、49例乙肝肝硬化患者(乙肝肝硬化組)、31例乙型肝炎患者(乙肝組)及40名健康體檢者(健康對照組)作為研究對象。乙肝相關肝癌組中男性35例，女性18例，年齡32～68歲，平均年齡(54.3±6.7)歲，均符合中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的2011版《原發(fā)性肝癌診斷指南》[3]中的相關標準，臨床病理資料詳見表3。53例乙肝相關肝癌患者中，23例患者采用微波消融術治療、21例行根治性手術治療、6例行肝動脈栓塞化療術治療、3例患者采取靶向治療。乙肝肝硬化組中男性29例，女性20例，年齡31～67歲，平均年齡(52.5±7.3)歲；乙肝組男性18例，女性13例，年齡28～62歲，平均年齡(53.6±6.9)歲；均根據(jù)2010版《慢性乙型肝炎防治指南》[4]進行診斷。健康對照組男性25例，女性15例，年齡28～66歲，平均年齡(54.7±5.8)歲。納入標準：①乙肝相關肝癌患者、乙肝肝硬化患者和乙型肝炎患者均為初診患者；②不合并其他嚴重疾病，如心力衰竭、慢性腎功能衰竭等。排除標準：①孕婦及哺乳期婦女；②HIV感染患者；③其他類型肝病患者；④合并其他惡性腫瘤患者。本研究四組患者在性別(χ2=0.737，P=0.865)、年齡(t=0.952,P=0.416)方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，且所有受試者均簽署知情同意書。

二、 方法

收集乙肝相關肝癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓等臨床病理資料。檢測并記錄治療前乙肝相關肝癌患者、乙肝肝硬化患者、乙型肝炎患者和健康對照者血清miR-132、GPC3表達水平及乙肝相關肝癌患者治療1個月后血清miR-132、GPC3水平等。通過影像學成像、患者狀況改善程度及肝功能情況評價乙肝相關肝癌患者治療1個月后的臨床療效。對53例乙肝相關肝癌患者進行為期1年的電話隨訪，觀察其1年生存情況。

三、 觀察指標

抽取四組受試者空腹靜脈血10 mL，3500 r/min離心10 min,取上層血清，放置于-80℃環(huán)境中，待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測受試者血清GPC3蛋白水平(試劑盒購自Blue Gene公司)。采用化學發(fā)光法檢測血清甲胎蛋白水平(試劑盒及化學發(fā)光免疫分析儀均購自美國雅培公司)。采用RT-PCR法檢測血清中miR-132表達水平。首先用miRNeasy Mini Kit提取分離試劑盒(德國QIAGEN公司)提取血清中總miRNA,當A260/A280介于1.8～2.0時，繼續(xù)后續(xù)操作。將總RNA逆轉錄成cDNA,反應條件為16℃ 15 min,42℃ 1 h，85℃ 5 min。使用TaqMan microRNA Assay檢測血清miR-132的水平。用2-△Ct計算血清miR-132的表達水平，△Ct=Ct(miR-132)-Ct(U6)。miR-132、內參U6引物序列均由上海吉凱基因化學技術有限公司提供。miR-132:上游5′-GCCGATAACAGTCTACAGC-3′,下游5′-CAG-TGCAGGGTCCGAGG-3′;U6:上游5′-GTGCGT-GTCGTGGAGTCG-3′,下游5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。相關檢測步驟嚴格遵從試劑盒及儀器說明書。

四、 統(tǒng)計學方法

結 果

一、 miR-132、GPC3在四組受試者血清中的表達

四組受試者血清中miR-132、GPC3水平比較，均差異有統(tǒng)計學意義(H=141.228、F=19.859，均P<0.001)。乙肝相關肝癌組患者血清miR-132水平低于乙肝肝硬化組、乙肝組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(U=-32.053、-82.088、-115.979，均P<0.05)。乙肝相關肝癌組患者血清GPC3水平高于乙肝肝硬化組、乙肝組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Q=6.474、8.090、9.890，均P<0.05)。詳見表1。

表1 四組受試者血清中miR-132、GPC3水平[M(Q1,Q3),]比較

注：與健康對照組比較，①P<0.05；與乙肝組比較，②P<0.05；與乙肝肝硬化組比較，③P<0.05

二、 血清miR-132、GPC3與乙肝相關肝癌患者臨床病理的關系

乙肝相關肝癌患者血清miR-132表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓有關(P<0.05)，與患者的年齡、性別和腫瘤直徑無關(P>0.05)。血清GPC3表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓均不相關(P>0.05)。詳見表2。

三、 乙肝相關肝癌患者治療前及治療1個月后血清miR-132、GPC3的動態(tài)變化

53例乙肝相關肝癌患者中，38例患者經(jīng)微波消融術、手術、肝動脈栓塞化療術或靶向治療后有效，腫瘤組織變小、患者狀況改善，肝功能恢復。38例乙肝相關肝癌患者血清miR-132水平升高，較治療前比較[3.8(1.9,5.5)對 1.1(0.9,1.4)×102]，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.663，P<0.001)；GPC3水平降低，較治療前比較[(1.4±0.3)對(1.7±0.7)ng/mL]，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.563，P=0.001)。

四、 乙肝相關肝癌患者1年生存情況

通過1年的電話隨訪得知，53例乙肝相關肝癌患者死亡13例，占24.5%，存活40例，占75.5%。

五、 血清miR-132、GPC3在不同預后乙肝相關肝癌患者的表達

乙肝相關肝癌生存組患者血清miR-132水平較死亡組患者高[1.2(1.0,2.0)對0.9(0.7,1.1)×102]，差異有統(tǒng)計學意義(Z=3.118，P=0.002)；GPC3水平低于死亡組患者[(1.7±0.6)對(2.2±0.8) ng/mL]，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.646，P=0.011)。

表2 血清miR-132、GPC3與乙肝相關肝癌患者臨床病理資料的關系

六、 血清miR-132、GPC3預判乙肝相關肝癌患者預后的價值

血清miR-132診斷乙肝相關肝癌患者預后的最大約登指數(shù)為0.398，其所對應的最佳截斷點為1.2；血清GPC3診斷乙肝相關肝癌患者預后的最大約登指數(shù)為0.417，其所對應的最佳截斷點為2.0 ng/mL。雖AUC miR-132>AUC GPC3、AUC聯(lián)合檢測>AUC miR-132，但均差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.575，P=0.565；Z=1.698，P=0.089)；AUC聯(lián)合檢測>AUC GPC3，差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.412，P=0.016)。詳見圖1及表3。

圖1 miR-132、GPC3及聯(lián)合檢測預判乙肝相關肝癌患者預后的ROC曲線

表3 miR-132、GPC3及聯(lián)合檢測預判乙肝相關肝癌患者預后的效能

討 論

目前，我國肝癌患者病死率較高，僅次于胃癌和肺癌。隨著醫(yī)學檢驗技術的發(fā)展，越來越多的腫瘤標志物被用于肝癌病情評估及預后診斷。有研究顯示[5-7]，miR-132可抑制肝癌細胞增殖和轉移，且與肝癌患者預后存在關聯(lián)；GPC3在正常和良性肝病肝細胞中不表達，其診斷肝癌的特異性較高。關于miR-132、GPC3的研究多數(shù)為組織學研究，鮮有血清學研究。因此，筆者檢測乙肝相關肝癌患者血清miR-132、GPC3表達水平，分析其與臨床病理資料的關系并觀察其1年生存情況，驗證其在乙肝相關肝癌病情、療效評估和預后診斷的價值。

研究表明[8]，miR-132在肝癌組織中低表達，其在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。本研究結果顯示，乙肝相關肝癌患者血清miR-132水平下降，其原因可能是乙肝相關肝癌患者肝癌細胞內miR-132表達減少，因此釋放到血液中的miR-132也隨之減少。本研究結果表明，乙肝相關肝癌患者血清miR-132表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓有關，與沙敏等[9]研究結果一致。GPC3高表達于肝癌組織，其可錨在細胞表面，調控其增殖、分化和轉移等[10]。本次研究中，乙肝相關肝癌患者血清GPC3表達水平最高，與乙肝肝硬化患者、乙型肝炎患者及健康對照者比較，均差異有統(tǒng)計學意義。通過分析乙肝相關肝癌患者血清GPC3水平與臨床病理資料的關系發(fā)現(xiàn)，其與患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和門靜脈癌栓均不相關，與多數(shù)學者研究結果一致。通過檢測經(jīng)手術、微波消融術、肝動脈栓塞化療術或靶向治療后有效的乙肝相關肝癌患者血清miR-132、GPC3水平，發(fā)現(xiàn)治療后血清miR-132表達水平升高，GPC3表達水平降低，提示血清miR-132、GPC3均可用于乙肝相關肝癌患者臨床療效評估。進一步驗證血清miR-132、GPC3預判乙肝相關肝癌患者預后的價值，結果表明，GPC3診斷乙肝相關肝癌患者1年后死亡的敏感度為69.2%，特異性為72.5%，臨床價值較低。miR-132診斷乙肝相關肝癌患者1年后死亡的敏感度為92.3%，特異性為47.5%。miR-132和GPC3聯(lián)合檢測可提高乙肝相關肝癌患者預后診斷的效能。血清miR-132和GPC3檢測具有方便、快捷、無創(chuàng)且依從性高等特點，有助于了解肝癌患者病情、療效及預后評估。

本研究屬于單中心研究，樣本量偏少，下一步將擴大樣本量，進行多中心研究并驗證本實驗結果的準確性。