大黃素抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤新生血管形成的機制研究

陳敏遠 徐錦波 王兆洪 胡萬樂

近30年大量研究證實，血管生成是許多腫瘤包括胰腺癌發生的早期事件，也是腫瘤侵襲和轉移的必要條件。微血管密度（MVD）作為檢測腫瘤新生血管形成的金標準由來已久，其是由CD31或CD34等內皮細胞標記物染色后顯微鏡下觀察、計算所得，與腫瘤的侵襲性密切相關[1]。血管內皮生長因子（VEGF）作為血管新生重要的促血管生成因子，與腫瘤新生血管形成密切相關[1]。血管生成素（angiopoietin，Ang）系統及其相關的因子是繼VEGF之后，人們發現的又一重要的內皮特異性的促血管生成因子。與VEGF不同，Ang系統作用于血管生成的晚期階段，誘導和維持內皮細胞遷移存活，在機體和腫瘤血管生成中發揮著重要的作用。Ang家族由Ang-1、Ang-2、Ang-3 和 Ang-4 組成，其中 Ang-1、Ang-2與它們共同的受體酪氨酸激酶受體2（Tie-2）與血管生成密切相關[2]。胰腺癌是典型的富血管性的腫瘤，其生長和轉移都依賴血管生成調節因子的調控。血管生成不僅為腫瘤細胞的生長提供了營養，更為腫瘤的浸潤和轉移提供了通路。本研究旨在探討大黃素對胰腺癌裸鼠原位移植瘤新生血管形成相關因子VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2表達的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要藥物和試劑 大黃素（純度＞98%，美國Sigma公司），用二甲基亞砜（DMSO）溶解（DMSO的終濃度小于 0.1%）；FBS、含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶、RPMI-1640培養基（美國Gibco公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（加拿大Fermentas公司）；Ang-1、Ang-2和VEGF抗體（美國Santa Cruz公司）；Tie-2抗體（美國 Abcam公司）；RT-qPCR反應所需引物由上海基康生物有限公司合成。

1.2 細胞株和動物 人胰腺癌細胞株SW1990購自美國組織培養庫。雌性BALB/c-nu/nu品系的裸小鼠40只，4～6周齡，體重18～20g，均購自中國科學院上海動物實驗中心。飼養于SPF級屏障系統的潔凈層流架內，室溫控制在（25±1）℃，相對濕度40%～60%。

1.3 細胞培養 人胰腺癌細胞株SW1990培養于含10%FBS的RPMI 1640培養基中,置于含5%CO2、37℃細胞培養箱中。待細胞單層貼壁穩定生長并鋪滿整個培養瓶時用胰蛋白酶消化傳代、分瓶培養，待建立動物模型。

1.4 動物模型制備

1.4.1 皮下移植瘤制備 取對數生長期的SW1990細胞（細胞數為2×106）進行裸鼠皮下注射，待生長成1cm3皮下移植瘤后取出，無菌條件下去除中央壞死組織，選取周圍健康腫瘤組織剪成1mm3的組織塊待用。

1.4.2 胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型制備 戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔麻醉裸鼠，左上腹直肌旁切口，暴露脾臟和胰尾，剪開胰腺被膜，將瘤塊植入胰尾，縫合胰尾被膜。共制備40只裸鼠原位移植瘤模型。

1.5 分組與給藥方法 手術后第3周開始給藥，將實驗動物采用隨機數字表法分為N組（腹腔注射，DMSO終濃度＜0.1%的氯化鈉注射液）、E20組（腹腔注射，20mg/kg大黃素）、E40組（腹腔注射，40mg/kg大黃素）、E80組（腹腔注射，80mg/kg大黃素）4組，每組10只，每周均治療3次，共治療2周[3]。

1.6 胰腺腫瘤重量測定及抑瘤率計算 末次用藥后1周頸椎脫臼法處死4組裸鼠，留取原位移植瘤并稱重，計算抑瘤率，抑瘤率＝（1-給藥組平均瘤質量/對照組平均瘤質量）×100%。

1.7 原位移植瘤微血管密度（MVD）測定 采用免疫組化法。取固定好的腫瘤組織，經脫蠟、水化、3%H2O2封閉以及高壓熱抗原修復后，加入兔血清封閉，一抗體4℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育30min，DAB顯色3～5 min，蘇木素復染后樹脂封片鏡檢。低倍鏡（×100）下尋取血管熱點區域，然后高倍鏡（×400）下隨機選擇5個視野，計數每個視野中CD31陽性細胞數，其平均值即為MVD[4]。

1.8 原位移植瘤Ang-1、Ang-2、Tie-2及VEGF mRNA表達水平測定 采用RT-qPCR法。按照Trizol試劑盒使用說明書從腫瘤組織提取總RNA，并計算RNA純度和濃度。選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的RNA進行后續試驗。根據說明書配置好反應液，加入隨機引物進行逆轉錄，采用羅氏染料進行熒光定量，β-actin為內參。由LightCycler Real Time PCR擴增儀獲取實驗數據。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.9 原位移植瘤中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白表達水平測定 采用Western blot法。取新鮮腫瘤組織，RIPA裂解液裂解組織，提取上清液，采用BCA方法測量定量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（50μg/孔），8%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳電泳，濕轉膜法轉膜，用含5%無脂牛奶TBST封閉，滴加一抗4℃孵育過夜，HRP標記的二抗孵育2h，用ECL發光液顯色。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參。采用Totallab 2.1軟件分析Western印跡圖像。以目的蛋白條帶與內參條帶吸光度值的比值反映VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白的相對表達量。

1.10 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組裸鼠原位移植瘤重量和抑瘤率的比較 E40組、E80組與對照組相比，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 4組裸鼠原位移植瘤重量和抑瘤率的比較

2.2 4組裸鼠原位移植瘤組織MVD的比較 4組裸鼠的MVD表達見圖1。其中N組MVD為19.3±1.9，E20組 MVD 為 11.7±1.6，E40 組 MVD 為 7.9±2.3，E80 組MVD為7.2±1.8。各試驗組MVD與對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

圖1 4組裸鼠原位移植瘤組織MVD的表達（a：N組；b：E20組；c：E40 組；d：E80 組；箭頭提示血管熱點區域；DBA 顯色，×400）

2.3 4組裸鼠原位移植瘤組織中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA表達水平的比較 E20組、E40組、E80組的VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA表達與N組相比，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

2.4 4組裸鼠原位移植瘤組織中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白表達水平的比較 E20組、E40組及E80組的VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白與N組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖2 4組裸鼠原位移植瘤組織中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA表達水平的比較（與對照組比較，*P＜0.05）

圖3 4組裸鼠原位移植瘤組織中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白表達水平的比較（a：4組 VEGF、Ang-1、Ang-2及 Tie-2蛋白表達水平的比較；b：4組 VEGF、Ang-1、Ang-2及 Tie-2蛋白表達的電泳圖；與對照組比較，*P＜0.05）

3 討論

大量實驗已經證實，腫瘤的生長依賴于血管新生[4]。隨著腫瘤MVD的增加，其侵襲周圍組織以及轉移至其他臟器的能力明顯增強。MVD被認為是預測腫瘤轉移、復發和預后的一項重要指標[5]。本研究通過對移植瘤組織中CD31的檢測，從而確定其MVD。在本研究中，大黃素各劑量組的MVD均＜N組，差異均有統計學意義。這一結果與之前的文獻報道相一致[3]，因此筆者推斷，大黃素可通過抑制腫瘤血管新生而抑制腫瘤的生長、發展。

VEGF作為血管新生重要的促血管生成因子，與腫瘤新生血管形成密切相關。本研究中課題組通過對胰腺癌裸鼠原位移植瘤組織中VEGF蛋白和mRNA的分析得到，VEGF在N組中蛋白以及mRNA均高表達，而在大黃素各劑量組中均低表達，且與大黃素濃度呈負相關。大黃素可能通過抑制VEGF的表達，使VEGF與其受體的結合減少[1]，從而降低其促血管生成的作用。

在血管形成的早期，VEGF可促進內皮細胞增殖和遷移，形成初級血管網，但是VEGF單純過表達誘導的新生血管是不成熟的，血管的成熟有賴于Ang/Tie通路的作用。生理狀態下，Ang-1和VEGF的作用相輔相成，在產生新生血管的過程中發揮著各自的功能。Ang-1與血管內皮細胞表面Tie-2受體結合，促進其磷酸化啟動這一信號通路，進而使血管周圍細胞圍繞內皮細胞，形成支架結構，使血管壁連續而完整，完成血管再構這一過程。所以Ang-1能維持血管的完整，對血管形成必不可少[6]。Ang-1在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、膽管細胞癌以及胰腺癌等多種腫瘤中扮演著不同的角色[7-9]。Ang-2是Ang-1的天然拮抗劑，通過與Ang-1競爭同一受體阻斷Ang-1的作用[6]。Ang-2與Tie-2受體結合后，可阻斷其磷酸化。Ang-2可抑制血管周圍細胞的聚集，使其不再圍繞內皮細胞形成支撐，也能促進內皮細胞的凋亡，減少周細胞覆蓋，導致血管處于一種不穩定狀態，從而促進血管新生的發生。Ang-2的促血管生成作用與局部微環境以及VEGF等生長因子密切相關[6,10]。當存在VEGF時，其可與VEGF協同刺激血管的出芽生長，形成新生血管[11]；而在沒有VEGF等生長因子存在的條件下，其可阻斷Ang-1穩定血管的作用，導致內皮細胞凋亡，顯微鏡下可見血管退化，微血管密度降低[8]。

本研究發現，大黃素可抑制Ang-1的表達，且大黃素各劑量組與N組相比差異有統計學意義。合理的解釋是，Ang-1表達減少使得Ang-1與VEGF協同形成新生血管的能力降低，減少了腫瘤組織微血管的形成。本研究還發現，大黃素可抑制Ang-2、Tie-2的表達，且大黃素各劑量組與對照組比較差異均有統計學意義。這表明大黃素可能一方面通過對VEGF表達的影響，從而影響Ang-2、Tie-2的表達以及作用，另一方直接作用于Ang-2、Tie-2，從而抑制其表達，達到抑制胰腺癌血管新生的作用。

本研究表明大黃素可抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤的血管新生，大黃素對血管新抑制方式可能是以通過抑制 VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-2 為主。該研究結果將為大黃素用于臨床胰腺癌治療提供一定的實驗依據，但還需進一步的動物實驗和臨床試驗加以驗證。