葫蘆素片對大鼠非酒精性脂肪肝病的預防作用

黃邀 吳惠蘭 肖銘澍

兒童非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在兒童無飲酒的情況下出現的以肝細胞脂肪變性和脂質堆積為特征的臨床綜合征。流行病學調查顯示兒童NAFLD的發病率為9.6%，肥胖兒童甚至高達38%，嚴重威脅兒童的身體健康[1]。至今，兒童NAFLD的發病機制尚不明確，加上兒童年齡的特殊性，藥物的不良反應比較多，不主張應用成人的減肥方法治療兒童肥胖癥和非酒精性脂肪肝，故干預其生活方式（控制飲食+運動）被認為是治療該病的關鍵。

葫蘆素片是一種傳統的護肝中藥，主要用于在慢性肝炎及原發性肝癌的治療，其作用機制是可以逆轉肝細胞免疫損傷，阻止其脂肪變性，抑制肝纖維增生，從而消退黃疸并降低肝酶[2]。本研究采用葫蘆素片治療NAFLD模型大鼠，觀察干預前后大鼠血清酶學、脂代謝、胰島素抵抗等指標及肝臟的病理學改變等，探討葫蘆素片對大鼠NAFLD的預防作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取健康的雄性SD大鼠36只，體質量 160～190g，鼠齡 4～6周，按4只/籠的密度進行飼養，環境溫度控制在20～26℃，設定明暗周期為12h（上午8：00～下午 8：00），先進行 1 周的適應性飼養，早晨定時定量投食，按需飲水，觀察大鼠攝食情況的變化。

1.2 試劑與設備 葫蘆素片（天津藥物研究院藥業有限責任公司，批準文號：國藥準字Z12020128，規格：0.1mg×10s×3板），大鼠胰島素試劑盒（ELISA 法）(美國R＆D公司分裝BM-E30093)，游離脂肪酸試劑盒（日本和光純藥工業株式會社），全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司AU5800）。

1.3 分組與建模方法 將大鼠根據隨機數字表法分為3組：Ⅰ組（普通飲食組）、Ⅱ組（高脂飲食組）和Ⅲ組（葫蘆素片干預組，高脂飲食+葫蘆素片），每組12只。大鼠在適應性飼養1周后開始實驗，Ⅰ組給予普通飼料。Ⅱ組給予高脂飼料（普通飼料+100g/kg豬油+20g/kg膽固醇[3]，喂養10周建立NAFLD動物模型）。Ⅲ組給予高脂飼料同時給予葫蘆素片灌胃，劑量為0.1 mg/次 (溶于2ml氯化鈉溶液)，2次/d，Ⅱ組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天上午9:00和下午3:00左右灌胃。3組大鼠喂養10周，每周定時稱體重1次，飼養結束時處死（飼養過程中均無死亡）。

1.4 血清指標、肝重及肝指數測定 所有大鼠處死前夜禁食達到空腹狀態，次日測量體重后，予2%戊巴比妥腹腔麻醉，腹主動脈采血后頸椎脫臼處死，測定血ALT、AST、TG、膽固醇（CHO）、脂蛋白 a（LPa）、LDL、HDL、游離脂肪酸（FFA）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、胞漿型磷脂酶 A2（cPLA2）、分泌型磷脂酶 A2（sPLA2）、鈣非依賴性磷脂酶A2（iPLA2）等指標，計算穩態模型胰島素抵抗指數（HOMA-IR）＝（FINS×FPG）/22.5，胰島素敏感指數（IAI）＝1/（FINS×FPG）。稱取肝臟濕重，計算肝指數，肝指數＝肝濕重/體重，取10g肝組織液氮速凍后保存于-80℃冰箱待檢測肝脂質，取肝右葉中部10g肝組織，以10%甲醛固定后用于病理學檢查或以戊二醛-鋨酸固定后用于電鏡檢查。

1.5 肝脂質測定 按100g肝組織：1ml Fovch溶劑（氯仿：甲醇體積比為2∶1配制）比例處理后，全自動生化分析儀測定標本CHO、TG含量，計算肝脂質，以mg/g肝組織表示。

1.6 肝臟病理學檢查 病理學診斷參照2005年美國國立衛生研究院NASH臨床研究網病理工作組指南，常規進行NAFLD活動度計分的脂肪變性計分（肝實質脂肪變性的范圍與評分：＜5%為0分，5%～33%為1分，33%～66%為2分，＞66%為3分）[4]，炎癥活動度計分標準則參考1981年Knodell等[5]提出的慢性肝炎組織學活動指數（肝門區無炎癥為0分，肝門區輕度炎癥為1分，肝門區中度炎癥為3分，肝門區顯著的炎癥為4分）。

1.7 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態分布資料先開平方根轉換成正態分布資料，再進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠體重、肝重、肝指數比較 試驗結束時，Ⅱ組大鼠體重、肝重、肝指數均高于Ⅰ組，Ⅲ組大鼠肝重、肝指數均高于Ⅰ組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠體重、肝重、肝指數比較

2.2 3組大鼠病理學檢查所見比較

2.2.1 肝臟大體改變 3組大鼠肝臟的顏色、邊緣、體積相比有明顯差異，Ⅰ組大鼠肝臟呈紅褐色，邊緣銳利，質地軟而富有彈性。Ⅱ組大鼠肝臟體積明顯增大，邊緣鈍而厚，表面光滑，表面及切面均呈黃色，油膩感明顯。與Ⅱ組相比，Ⅲ組肝臟的體積略增大，邊緣稍鈍，表面及切面亦呈黃色，但油膩感不如Ⅱ組，見圖1（插頁）。

2.2.2 光鏡下肝組織改變 HE染色下3組大鼠的肝細胞形態、肝索、肝竇及匯管區結構及脂肪變性程度均有明顯差異，Ⅰ組肝索結構清楚，肝細胞形態正常，匯管區和中央靜脈結構清楚，肝血竇內少許炎癥細胞浸潤。Ⅱ組肝細胞存在彌漫性大泡性脂肪變性，伴有氣球樣變性，肝小葉內見到點灶狀壞死，灶性炎癥細胞浸潤，肝血竇受擠壓變窄。Ⅲ組肝細胞存在廣泛的大泡性脂肪變性，與Ⅱ組差異不明顯，肝小葉內見到散在的炎癥細胞浸潤，見圖2。

圖1 3組大鼠肝臟大體改變（a：Ⅰ組；b：Ⅱ組；c：Ⅲ組）

圖 2 3 組大鼠光鏡下肝組織改變（a：Ⅰ組；b：Ⅱ組；c：Ⅲ組，HE 染色，×200）

2.2.3 電鏡下肝組織改變 3組大鼠肝細胞的線粒體、內質網等細胞器結構變化有明顯差異，Ⅰ組肝細胞內線粒體、粗面內質網等細胞器結構清楚。Ⅱ組肝細胞內線粒體腫脹明顯，線粒體脊結構模糊不清，見到多量脂滴堆積，內質網腫脹明顯，表面顆粒脫落。Ⅲ組肝細胞內線粒體高度腫脹，線粒體脊模糊不清，可見脂滴，內質網腫脹，表面顆粒脫落，與Ⅱ組差異不明顯，見圖3。

圖 3 3 組大鼠電鏡下肝組織改變（a：Ⅰ組；b：Ⅱ組；c：Ⅲ組，透射電鏡，×40 000）

2.3 3組大鼠肝功能、血脂等指標的比較 Ⅱ、Ⅲ組ALT、TG、CHO、LPa、LDL 均高于Ⅰ組，Ⅲ組 ALT 低于Ⅱ組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

2.4 3組大鼠血糖及胰島素抵抗指標的比較 Ⅱ、Ⅲ組FINS均高于Ⅰ組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表2 3組大鼠血清生化指標的比較

表3 3組大鼠血糖及胰島素抵抗指標的比較

2.5 3組大鼠肝臟脂質、脂肪變性及炎癥活動度比較 Ⅱ、Ⅲ組TG、CHO均高于Ⅰ組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。Ⅱ、Ⅲ組肝臟脂肪變性程度較Ⅰ組嚴重，Ⅱ組炎癥活動度較Ⅰ組嚴重，Ⅲ組炎癥活動度較Ⅱ組輕，見表4。

2.6 3組大鼠FFA、LPC及PLA2水平比較 Ⅱ、Ⅲ組FFA、LPC、sPLA2水平高于 I組，Ⅲ組 LPC、sPLA2水平低于Ⅱ組，差異均有統計學意義（均P＜0．05），各組cPLA2、iPLA2水平比較差異均無統計學意義（均P＞0．05），見表 5。

表4 3組大鼠肝臟脂質、脂肪變性及炎癥活動度比較（mg/g）

表5 3組大鼠血清FFA、LPC及PLA2水平比較

3 討論

NAFLD的發病機制尚不明確，是由多種病因引起的脂質在肝細胞內蓄積過多導致的臨床病理綜合征，不論對成人還是兒童的健康都會造成很大的影響。資料表明近10年內NAFLD呈現低齡化的趨勢，以肥胖兒童更為突出，國內報道肥胖兒童和青少年中NAFLD的檢出率高達23.33%～59.57%，明顯高于國外，這與近幾年肥胖兒童增加、肥胖程度加重都有關[6]。本研究顯示Ⅱ組的大鼠體重和肝重明顯超過Ⅰ組，形成并達到肥胖水平，同時該組大鼠肝脂質超過Ⅰ組大鼠，肝細胞脂肪變性嚴重，形成非酒精性脂肪肝。

NAFLD的病理改變程度不一，可以從單純的脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），伴或不伴有肝纖維化，最后發展為肝硬化、甚至肝細胞癌。肝活檢病理分析是區分單純脂肪變性和NASH最明確的方法，而且可同時進行疾病嚴重程度分級，但是作為一項有創操作，肝活檢并不能被所有NAFLD的患兒及家長所接受。ALT是兒童代謝綜合征的一個生化指標，脂肪肝患兒常有該酶水平的升高，年齡≥10歲的超重和肥胖兒童ALT≥80U/L診斷NAFLD靈敏度為57%，特異度為71%[7]，故本研究團隊有必要對肥胖及超重合并高危因素的患兒常規進行肝功能篩查。葫蘆素是一種從葫蘆科及其他科屬多種植物中提取的苦味苷元成分，具有多種生物活性，可以起到保肝、降酶、退黃的作用。研究表明，葫蘆素片能提高血漿cAMP水平、調節肝蛋白濃度，增加cAMP/cGMP比，改善受損肝細胞的ALT異常，促進肝細胞修復閉[8]。本實驗利用高脂飲食構建大鼠NAFLD的動物模型，檢測大鼠體重、肝重和肝臟的組織病理、血ALT、AST、FINS、HOMA-IR、IAI、FFA、TG、CHO、LDL、LPa等，發現經葫蘆素片干預能明顯降低NAFLD大鼠的血清谷丙轉氨酶水平，減輕干細胞的炎性病變程度，也能一定程度地降低血清TG、FFA、LPC、sPLA2水平，改善胰島素抵抗。這提示筆者早期給予葫蘆素片干預可以降低大鼠的血脂和肝脂質，減輕肝細胞炎性病變程度，對NAFLD的發生起到一定的預防作用。