異甘草素預處理對老齡大鼠術后認知功能及BDNF通路的影響

吳艷瓊 許先成 孫艷玲 昌睿杰 李清

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD）是老年患者術后常見的中樞神經系統并發癥，主要表現為焦慮、人格改變、學習記憶受損等[1-2]。POCD嚴重影響患者術后生活質量，甚至增加遠期病死率[3]，且確切發病機制尚不清楚，如何防止也缺乏有效手段。近年來研究發現，腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及其受體酪氨酸激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)信號通路能調控神經元增殖與分化、突觸可塑性、神經遞質釋放等，在丙泊酚所致POCD中扮演重要角色[4]。異甘草素（lsoliquiritigenin，ISL）是從甘草中提取的一種黃酮類物質，具有抗炎、抗氧化[5]、抗神經元凋亡[6]、改善學習記憶等作用[7]。本研究旨在觀察ISL預處理對老齡大鼠術后認知功能及BDNF通路的影響，以進一步探討該疾病的發病機制和防治方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級健康雄性老齡SD大鼠54 只，18～20 月齡，體重 500～600g，均由湖北醫藥學院動物實驗中心提供，并經湖北醫藥學院動物倫理委員會批準。采用隨機數字表法將其分為對照組（C組）、手術組（S組）、ISL+手術組（P組），每組18只。

1.2 試劑與設備 ISL由湖北醫藥學院藥學部提供（天津馬克生物技術有限公司產品，批號:GC-20120203，規格：20mg）；Western blot試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號:G2003）；BDNF、TrkB 抗體（中國 biosharp公司，批號:BL003A）；肌動蛋白（β-actin）抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號:GB1101）；Morris水迷宮設備（上海欣軟科技有限公司，型號：XR-XM101）。

1.3 Morris水迷宮實驗 參照文獻[8]，3組大鼠于術前5d進定位航行實驗，訓練4次/d，將水迷宮宮體均分為4個象限，水溫維持25℃左右，將逃生平臺固定于第1象限，位于水下0.7cm處，保持平臺周圍參照物恒定，通過懸于水池上方攝像頭對大鼠活動進行圖像分析處理。將大鼠置于平臺上適應30s，之后將大鼠從4個象限隨機放入水中，記錄大鼠入水到站于平臺上所需時間，即為逃避潛伏期；記錄大鼠從入水至找到平臺游過的路線長度為總路程，即為游泳距離。若大鼠60s仍未找到平臺，則將其引至平臺，在平臺停留10s，然后進行下一次訓練。取術前5d測試結果的平均值作為術前值，分別于術后 1、3、7d再次行水迷宮實驗，記錄大鼠逃避潛伏期和游泳距離。

1.4 動物模型制備 采用10%水合氯醛腹腔注射（0.3ml/100g）麻醉大鼠，在其失去翻正反射后仰臥位固定大鼠，清潔消毒腹部皮膚，于肋下0.5cm處沿腹中線作一約3cm左右的縱向切口，每5min進行一次腹腔探查術（包括肝、胃、小腸、大腸），總手術時間20min，探查完成后關閉腹腔[9]。C組麻醉后不進行手術，S、P組行剖腹探查術；P組于手術前連續5d給予15mg/kg的ISL灌胃（0.5g ISL溶于0.9%氯化鈉溶液100ml），C、S組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.5 Western blot法檢測海馬區BDNF、TrkB蛋白表達 分別于術后 1、3、7d水迷宮實驗結束后，采用隨機數字表法取其中6只大鼠處死，分離海馬組織，將腦組織進行勻漿研磨；加入蛋白裂解液，充分裂解離心后取上清液進行SDS-PAGE電泳；電泳分離后將蛋白轉移至PVDF膜上，將膜轉至含封閉液的平皿中，封閉2h；加入BDNF及TrkB一抗，室溫孵育2h；TBST緩沖液洗膜3次、每次5min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2h；洗膜3次、每次5min，將膜置入顯影液，充分接觸并顯影，采用成像分析系統對顯影膠片進行分析與掃描。以目的蛋白條帶與內參（β-actin）條帶吸光度值的比值反映BDNF、TrkB蛋白的相對表達量。

1.6 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；水迷宮實驗數據術后各時點比較采用重復測量數據的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠各時點逃避潛伏期比較 與術前比較，S、P組大鼠術后各時點逃避潛伏期均明顯延長（均P＜0.01）；與C組比較，S、P組術后各時點逃避潛伏期均明顯延長（均P＜0.01）；與S組比較，P組術后各時點逃避潛伏期均明顯縮短，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表 1。

表1 3組大鼠各時點逃避潛伏期比較（s）

2.2 3組大鼠各時點游泳距離比較 3組大鼠術前游泳距離比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與術前比較，S、P組大鼠術后各時點游泳距離明顯延長；與C組比較，S、P組大鼠術后各時點游泳距離明顯延長；與S組比較，P組大鼠術后各時點游泳距離明顯縮短，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表2。

2.3 BDNF、TrkB蛋白表達量比較 與C組比較,術后各時點S、P組BDNF、TrkB蛋白表達量降低（P＜0.05）；與S組比較，術后各時點P組BDNF、TrkB蛋白表達量增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3、圖 1。

表2 3組大鼠各時點游泳距離比較（cm）

表3 3組大鼠各時點海馬區BDNF、TrkB蛋白表達量比較

圖1 3組大鼠各時點海馬區BDNF、TrkB蛋白表達的電泳圖（n=6）

3 討論

以往對POCD的相關研究多集中于心臟手術，近年來研究發現，在非心臟手術患者中POCD的發病率高達40%～50%，隨著人口老齡化的增加，POCD的發生率亦隨之增高，因此預防及治療POCD具有重要的臨床意義。本實驗通過剖腹探查術建立傷害性刺激模型，結果表明與C組比較，S、P組小鼠術后認知功能明顯降低，證實手術引起的傷害性刺激參與POCD的發生。

現代藥理表明，甘草除具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調節等作用外，還具有顯著的神經保護作用[10]。ISL為甘草中有效成分之一，在神經保護方面主要有抗缺血再灌注損傷[11]、抗氧化[12]、改善學習及記憶能力等作用[13]。詹春等[14]發現ISL可改善小鼠腦缺血再灌注損傷所致學習記憶障礙、改善異常腦血流及腦組織能量代謝,在腦缺血再灌注腦損傷中發揮保護作用。因此本實驗通過大鼠相關行為學指標檢測，深入探討ISL預處理對于大鼠術后認知功能的影響。

Morris水迷宮常作為神經退行性疾病動物模型研究方法之一，用于評估學習認知和空間記憶等行為學，且檢測老年動物認知功能減低較為敏感[15]。本研究于術前5d進行定位航行實驗，顯示各組逃避潛伏期及游泳距離差異無統計學意義，證實在給予ISL預處理后，對于正常大鼠認知能力未見明顯影響。術后1、3、7d，與S組比較，P組逃避潛伏期和游泳距離明顯縮短，表明ISL預處理對于術后大鼠認知功能下降有一定的改善作用。

BDNF是由神經元、神經膠質細胞等多種細胞合成和分泌的神經營養蛋白,它對參與情感和認知功能的關鍵腦區回路中的神經元的生存、生長和維持起著至關重要的作用[16]。BDNF與細胞膜上的TrkB受體特異性結合后,可以通過激活下游信號分子促進促進神經元增殖與凋亡等,參與認知功能的調節[17]。研究發現敲除BDNF基因的小鼠，其TrkB蛋白表達明顯下降，小鼠學習能力出現障礙[18]。BDNF信號通路參與了多種神經系統疾病中認知功能障礙的發生與發展,且使用TrkB激動劑激活BDNF-TrkB信號通路后,認知功能得到改善。已被證實BDNF的表達受傷害性刺激影響，炎癥因子（IL-6、IL-1β等）可以抑制神經細胞BDNF的合成和表達。阿爾茲海默癥模型中證實，ISL能有效抑制上述炎性因子的生成，上調BDNF表達[19]。因此本實驗預測ISL可通過抑制炎癥作用調控BDNF-TrkB信號通路，改善術后認知功能。實驗結果證實了該假說，通過對海馬區BDNF、TrkB蛋白含量進行了相關檢測，顯示與S組比較，P組大鼠術后各時點海馬區BDNF、TrkB蛋白表達水平明顯增加，提示ISL能夠有效增強BDNF-TrkB信號通路的活化，改善老齡大鼠術后的認知功能。

本實驗僅對創傷性刺激所致的POCD進行了相關研究，未進行BDNF-TrkB信號通路上、下游基因檢測，也未進行術后更長時間的認知功能的評估，這可在今后的研究中進一步探討。