脆性組氨酸三聯(lián)體和鼠雙微體蛋白2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及意義

張春霆 林英立 徐旻 劉冉錄 徐勇

膀胱尿路上皮癌與多種癌基因及抑癌基因異常表達(dá)有關(guān)，脆性組氨酸三聯(lián)體基因（fragile histidine triad gene，F(xiàn)HIT）在多種腫瘤組織中呈陰性表達(dá)[1-3]。鼠雙微體2蛋白基因（murine doubleminute proteingene 2，MDM2）表達(dá)增高可抑制類胰島素樣生長因子2的mRNA結(jié)合蛋白質(zhì)（p62蛋白），以促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[4-5]。筆者通過對FHIT和MDM2蛋白在Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫查詢比對后，發(fā)現(xiàn)在膀胱尿路上皮癌中FHIT蛋白表達(dá)下降與MDM2蛋白表達(dá)增高密切相關(guān)，且FHIT蛋白表達(dá)下降及MDM2蛋白表達(dá)增高與膀胱腫瘤預(yù)后存在相關(guān)性。但FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的相關(guān)性尚未見報(bào)道，本研究對FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，探討兩種蛋白之間及其與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 選取金華市人民醫(yī)院（44例）、徐州市腫瘤醫(yī)院（9例）、浙江大學(xué)金華醫(yī)院（10例）和天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院（9例）2009至2017年接受手術(shù)的膀胱尿路上皮癌患者的標(biāo)本共72例，以及金華市人民醫(yī)院（32例）、浙江大學(xué)金華醫(yī)院（10例）正常膀胱尿路上皮組織共42例。術(shù)前均無放化療及膀胱灌注史。72例患者中，男 42例，女 30 例，年齡 32～77（62.0±5.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：再次經(jīng)病理檢查證實(shí)為膀胱尿路上皮癌,無其他部位腫瘤；分期臨床資料完整，術(shù)前均未進(jìn)行全身和膀胱灌注化療、放療和免疫治療。分化程度為Ⅰ級47例，Ⅱ～Ⅲ級25例；分期（根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)）為：Tis～T1期 38 例，T2～T4期 34 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 54例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例；有吸煙史38例，無吸煙史34例。

1.2 方法 鼠抗人FHIT蛋白（工作濃度1:100，規(guī)格：100μg，批號：BS6237）及鼠抗人 MDM2 蛋白（工作濃度1:150，規(guī)格：200μg，批號：abs130145）單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺色試劑盒均購于福建邁新生物技術(shù)有限公司。組織常規(guī)石蠟包埋，以4μm厚度連續(xù)切片6張，分別作HE染色和免疫組化染色；免疫組化染色方法按說明書操作進(jìn)行，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，用已知FHIT、MDM2蛋白陽性切片作為陽性對照；由兩位病理科醫(yī)師讀片以保證準(zhǔn)確性。

1.3 結(jié)果判定 每張切片在高倍鏡下選定5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中腫瘤細(xì)胞的百分比，參照免疫組化半定量評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色百分?jǐn)?shù)評分：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜50%時(shí)FHIT蛋白染色結(jié)果為（-），陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≥50%時(shí)FHIT蛋白染色結(jié)果為（+）；MDM2蛋白染色結(jié)果判定同上。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá) FHIT蛋白表達(dá)定位于胞質(zhì),呈棕黃色顆粒狀；MDM2蛋白在正常組織中不表達(dá)，陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核、胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。兩種蛋白在Ⅰ級和Ⅱ～Ⅲ級膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)見圖1a、b。

圖1 兩種蛋白在Ⅰ和Ⅱ～Ⅲ級膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)（a：FHIT在Ⅲ級膀胱尿路上皮癌中表達(dá)；b：MDM2在Ⅰ級膀胱尿路上皮癌中表達(dá)；免疫組化染色，×200）

2.2 FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 FHIT蛋白在膀胱尿路上皮癌中的陰性表達(dá)率為58.3%，在正常膀胱尿路上皮中為4.8%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有吸煙史的FHIT蛋白陰性表達(dá)率為86.84%，無吸煙史的為29.41%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。FHIT蛋白陰性表達(dá)率與膀胱尿路上皮癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、吸煙、年齡均有關(guān)（均P＜0.05），而與性別無關(guān)（P＞0.05）。MDM2蛋白在膀胱癌中陽性表達(dá)率為63.89%，在正常膀胱尿路上皮中為7.69%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MDM2蛋白陽性表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、吸煙均有關(guān)（均P＜0.05），與年齡、性別均無關(guān)（均P＞0.05），見表 1。

2.3 FHIT與MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)的相關(guān)性 FHIT與MDM2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.816，P＜0.05），見表 2。

表1 FHIT和MDM2蛋白與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征之間的關(guān)系[例（%）]

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)膀胱尿路上皮癌的演化和進(jìn)展是多步驟、多階段、多基因參與的[6]，F(xiàn)HIT基因在膀胱尿路上皮癌中的陰性表達(dá)與膀胱尿路上皮癌預(yù)后相關(guān)[7-10]，MDM2有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的生物學(xué)作用，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化和惡變能力，而FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展過程中是否有相關(guān)性，未見報(bào)道。

在膀胱尿路上皮癌早期，F(xiàn)HIT蛋白陰性表達(dá)率明顯上升、甲基化可能是因素之一[11-12]。本研究中72例膀胱尿路上皮癌組織FHIT蛋白陰性表達(dá)率58.33%，42例癌旁正常膀胱尿路上皮組織FHIT蛋白陰性表達(dá)率為4.76%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)HIT蛋白陰性表達(dá)與膀胱尿路上皮癌患者年齡、吸煙、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度均有關(guān)，與性別無關(guān)，這也證明了FHIT是容易受到外界干擾而突變的基因，年齡也可能影響FHIT基因突變；Stein等[13]實(shí)驗(yàn)表明，煙草致癌物增加了染色體脆性部位的表達(dá)導(dǎo)致FHIT基因陰性表達(dá)，這結(jié)果在本研究發(fā)現(xiàn)FHIT蛋白在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)下降得到了證實(shí)，在對吸煙和非吸煙患者FHIT蛋白表達(dá)情況研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者FHIT蛋白陰性表達(dá)率（86.84%）明顯高于非吸煙者（29.41%），推斷煙草類等環(huán)境致癌物可能影響FHIT蛋白表達(dá)，煙草類物質(zhì)導(dǎo)致FHIT異常可能是膀胱尿路上皮癌中的頻發(fā)事件，其異常表達(dá)與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。FHIT蛋白隨分化程度的降低,陰性表達(dá)率有增高的趨勢；FHIT蛋白陰性表達(dá)使腫瘤增殖能力及侵襲性逐漸增加[14]。伴隨著FHIT蛋白表達(dá)的異常，MDM2蛋白也出現(xiàn)異常表達(dá)，研究表明激活p62基因能誘導(dǎo)MDM2基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后MDM2蛋白又使p62蛋白失活、降解，限制p62增高表達(dá)，從而保持細(xì)胞內(nèi)MDM2/p62穩(wěn)定[15]。MDM2陽性表達(dá)可以抑制p62，本研究中MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中陽性表達(dá)率為63.89%，正常膀胱尿路上皮為7.14%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MDM2蛋白也是膀胱尿路上皮癌發(fā)生中的重要因素，MDM2蛋白陽性表達(dá)率與膀胱尿路上皮癌組織的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、腫瘤大小、吸煙有關(guān)，與性別及年齡無關(guān)，MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中是否有相同的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究證實(shí)；本研究對FHIT和MDM2蛋白作單邊相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT蛋白陰性表達(dá)與MDM2蛋白陽性表達(dá)相關(guān)，兩者呈負(fù)相關(guān)，提示在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展中兩者可能起協(xié)同作用。

FHIT蛋白陰性表達(dá)有利于腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，MDM2蛋白的陽性表達(dá)促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，聯(lián)合檢測上述兩項(xiàng)指標(biāo)，可為判斷膀胱癌的惡性程度及轉(zhuǎn)移潛能作重要參考。