蘆丁對D-半乳糖誘導衰老小鼠認知功能的保護作用研究

石茜 何守玉 霍麗霞 徐永強 王翔

衰老是一個漸進緩慢的過程，常見的相關性疾病有帕金森病（PD）和阿爾茨海默病（AD）。據報道，活性氧（ROS）的產生與抗氧化酶活性之間的不平衡導致的氧化損傷在衰老過程中起關鍵作用[1]。蘆丁是許多傳統中草藥中常見的黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化特性[2-3]和抗炎活性[4]，已證明蘆丁可對6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導的PD樣和A-β42誘導的AD樣損傷具有保護作用[3]。但蘆丁在衰老引起的認知功能下降中的作用和機制很少有報道。維生素E很早就被證明是親脂類自由基的清除劑，在神經保護方面發揮重要作用[5]。黃榕祥等[6]證明維生素E可通過抗氧化作用保護海馬神經元，改善衰老大鼠空間認知功能。因此在本研究中，筆者利用維生素E作為陽性對照,利用D-半乳糖（公認的衰老模型誘導劑[7]）構建小鼠衰老模型，研究蘆丁對衰老小鼠認知功能的保護機制，以期為衰老引起的認知功能障礙提供新的治療和預防思路。

1 材料和方法

1.1 試劑 蘆丁、D-半乳糖和維生素E（美國Sigma公司）；尼氏染色試劑盒（中國碧云天公司）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；一抗：兔微管相關蛋白-2（MAP-2）抗體（美國 Millipore公司，1∶200）、抗半胱天冬酶-3（Caspase-3）抗體（美國 Bioworld 公司，1∶200）和鼠膠質纖維酸性蛋白（GFAP）抗體（美國Millipore公司，1∶600）；二抗：羊抗兔 IgG（重鏈+輕鏈）（美國 Bioworld公司，1∶200）;羊抗鼠超敏二步法（polink-2）加聚合物（北京中山金橋公司）。

1.2 動物和藥物處理 雄性ICR小鼠80只，體重18～22g，均購自南通大學實驗動物中心。實驗前這些動物適應本實驗室環境1周。所有流程均已通過南通大學動物保護與利用委員會和江蘇省動物保護倫理委員會批準[批準文號：SYXK（SU）2007-0021]。

1.2.1 動物分組及模型構建 衰老小鼠評價指標中，SOD活力降低是最重要的參考指標[8]，目前給藥劑量無統一規定，一般 50～500mg·kg-1·d-1不等，連續 6～8 周即可構建小鼠衰老模型[9]。本研究采用直接抽取法將小鼠分成對照組、D-半乳糖組、D-半乳糖+蘆丁組和D-半乳糖+維生素E組，每組20只，其中8只用于T-SOD、GSH-PX活性檢測和MDA水平測定，8只用于NOS活性和NO水平檢測，4只用于制作多個腦組織冷凍切片，進行海馬神經元計數及MAP-2等指標檢測。對照組接受每日皮下注射0.9%氯化鈉注射液和0.5%羧甲基纖維素鈉注射液（與非水溶性藥物粘合乳化，利于藥物溶水）。D-半乳糖組小鼠每日皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg），口服0.5%羧甲基纖維素鈉懸液6周。D-半乳糖+蘆丁組小鼠每日皮下注射D-半乳糖（100mg/kg），口服含蘆丁（25mg/kg）的0.5%羧甲基纖維素鈉懸液6周。D-半乳糖+維生素E組小鼠每日皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg），口服含維生素 E（25mg/kg）的 0.5%羧甲基纖維素鈉懸液6周。

1.2.2 Morris水迷宮測試 經過6周的治療后，在水迷宮中評估所有小鼠的空間學習能力，該裝置由長、寬、深分別為73、42、20cm的黑色有機玻璃矩形罐組成。容器包括1個起點，1個終端平臺和4個無平臺設施。在水迷宮中填充水深12cm，溫度控制在（22±1）℃。在訓練的第1天，讓每只老鼠停留在終端平臺上30s以識別該位置，并將其放置在面對泳池墻的水中，在第1個起始點包含無平臺設施，記錄每次試驗找到終端平臺的逃避潛伏期。如果在2min內找不到梯子，游泳時間被定為2min。小鼠連續6d接受試驗。對于所有的試驗，通過計算機化的視頻成像分析系統（中國醫學科學院材料醫學研究所）測量并計算6d內所有小鼠的逃避潛伏期、游泳距離和游泳路徑。

1.2.3 生化指標檢測 在最后1次行為測試后24h進行生化指標檢測。每組16只小鼠通過斷頭處死，小心地去除大腦并用冰冷的等滲氯化鈉溶液沖洗。海馬在冷氯化鈉溶液中制備成100g/L勻漿，用于測定T-SOD、GSH-Px和NOS活性以及MDA、NO含量。所有檢查均按說明進行。

1.3 海馬區神經元損傷情況檢測 采用甲酚紫染色法。對海馬神經元進行染色，顯微鏡（德國Leica公司，DM4000顯微鏡）下觀察，計算海馬CA1區域中陽性細胞的數量（0.27mm2）。測量4對雙側腦組織切片，計算每對腦切片陽性細胞數平均值，并將該值用于進一步的統計分析。

1.4 免疫組化染色 對于MAP-2標記，將腦組織切片在四乙基若丹明異硫氰酸酯（TRITC）偶聯的羊抗兔IgG中孵育，用于觀測海馬神經元樹突完整性情況；對于Caspase-3和GFAP標記，切片用羊抗鼠polink-2加聚合物溫育，分別用于觀測海馬神經元凋亡情況與星型膠質細胞損傷情況。用計算機圖像分析系統拍攝海馬CA1和頂葉皮層的照片（德國Leica公司，DM4000B顯微鏡）。計算海馬中陽性細胞的數量（Caspase-3為0.07mm2，GFAP為0.27mm2）。測量4對雙側腦切片，計算每對腦切片陽性細胞平均值，并將該值用于進一步的統計分析。

1.5 統計學處理 采用Graphpad 5.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠逃避潛伏期、游泳距離和游泳路徑比較 與對照組比較，在訓練的第5、6天時D-半乳糖組逃避潛伏期與游泳距離均延長（均P＜0.05）；與D-半乳糖組比較，在訓練的第5、6天時D-半乳糖+蘆丁組與D-半乳糖+維生素E組逃避潛伏期與游泳距離均縮短（均P＜0.05）見圖1a和b。圖1c顯示了第2、6天試驗中4組小鼠的游泳路徑，與訓練2d比較，4組小鼠訓練6d游泳到達終端平臺的路徑明顯縮短。

圖1 Morris水迷宮實驗檢測實驗各組小鼠認知功能（a：4組小鼠的逃避潛伏期比較；b：4組小鼠的游泳距離比較；與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 D- 半乳糖組比較，△P＜0.05；c：在第 2天和第6天的試驗中小鼠的代表性游泳路徑）

2.2 4組小鼠海馬中抗氧化酶活性和氧化產物水平比較 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠海馬中MDA水平增加（P＜0.05），T-SOD和GSH-Px的活性均明顯降低（均P＜0.01）；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組小鼠海馬中T-SOD、GSH-Px活性均被逆轉恢復（均P＜0.05），MDA 水平明顯降低（P＜0.01）；D-半乳糖+維生素E組小鼠海馬中T-SOD和MDA水平活性均被逆轉恢復（均P＜0.05），但對降低的GSH-Px活性沒有產生任何明顯影響，見表1。

表1 蘆丁對D-半乳糖誘導衰老小鼠海馬中T-SOD，GSH-Px和MDA水平的影響

2.3 4組小鼠海馬神經元損傷情況 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠腦組織切片甲酚紫染色顯示海馬CA1區有明顯損傷并伴神經元丟失，完整神經細胞數明顯減少（P＜0.01）；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組與D-半乳糖+維生素E組小鼠腦組織切片染色顯示海馬CA1區的損傷及神經元丟失情況均有所好轉，完整神經細胞數均增加（均P＜0.05），見圖2（插頁）和表2。

表2 鼠腦海馬CA1區完整神經細胞數（個）

2.4 4組小鼠海馬神經元凋亡情況 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠海馬中凋亡陽性細胞明顯增加（P＜0.01）；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組與D-半乳糖+維生素E組小鼠海馬中凋亡陽性細胞均明顯減少（均P＜0.05），見圖 3（插頁）和表 3。

表3 鼠腦海馬CA1區Caspase-3陽性細胞數（個）

2.5 4組小鼠海馬神經元樹突完整性比較 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠的頂葉皮質和海馬CA1神經元的樹突變短且丟失；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組與D-半乳糖+維生素E組中未檢測到類似的破壞，見圖4（插頁）。

圖4 鼠腦中頂葉皮質和海馬CA1區樹突分支和結構的觀察（a～d：4組小鼠頂葉皮質神經樹突結構；e～h：4組小鼠海馬CA1區神經樹突結構；MAP-2免疫組織化學染色，×100）

圖5 鼠腦海馬區星形膠質細胞損傷情況（a：對照組；b：D-半乳糖組；c：D-半乳糖+蘆丁組；d：D-半乳糖+維生素E組；GFAP免疫組織化學染色，×100）

2.6 4組小鼠海馬中的星形膠質細胞損傷情況 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠海馬中損傷腫脹的星形膠質細胞GFAP信號增強（P＜0.01），細胞釋放總NO水平和NOS活性均明顯增加（均P＜0.01）；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組海馬星形膠質細胞中GFAP信號較低（P＜0.05），NOS活性和NO水平均明顯降低（均P＜0.01），同時D-半乳糖+維生素E組小鼠海馬星形膠質細胞中NOS活性和NO水平均表現出相似的降低趨勢（均P＜0.05），見圖 5（插頁）、表 4、5。

表4 GFAP陽性細胞數（個）

表5 蘆丁對D-半乳糖誘導衰老小鼠海馬星型膠質細胞中NOS和NO釋放的影響

3 討論

蘆丁對神經的保護作用已被大量研究報道，其在認知功能上的良好效果也逐漸被人們所了解，由于蘆丁和/或其代謝物有穿過血腦屏障的能力，它被證明可以改變認知以及神經退行性疾病的各種行為癥狀，對阿爾茲海默病具有一定的治療潛力[10]。此外，也有研究證明蘆丁對1型糖尿病引起的認知功能障礙也有緩解作用[11]，然而，蘆丁在衰老引起的認知功能減退中的作用很少有報道。本研究中，筆者首先驗證了D-半乳糖（100mg/kg）處理小鼠6周后，其在Morris水迷宮中的性能顯著下降，而長期口服蘆丁合并D-半乳糖處理的小鼠逃避潛伏期和游到平臺的距離顯著降低和縮短，表明蘆丁具有改善由D-半乳糖誘導的認知缺陷的潛力。

本研究也明確地證明蘆丁可以抑制神經元丟失，抑制海馬神經元細胞的凋亡，從而提高D-半乳糖處理小鼠的空間學習和記憶能力。甲酚紫染色顯示蘆丁對海馬神經元的保護作用，防止D-半乳糖誘導的海馬神經元丟失和細胞凋亡。軸突和樹突的完整性對于ChAT運輸是重要的[12]。在這項研究中，筆者檢測了MAP-2的表達以觀察含或不含蘆丁的D-半乳糖處理的小鼠中的樹突變化。筆者發現在D-半乳糖處理的小鼠的頂葉皮層和海馬區域中MAP-2陽性樹突具有顯著的損傷。蘆丁處理后，樹突比D-半乳糖處理的小鼠更加完整，并且這種樹突完整性可能在中樞膽堿能系統和認知功能中起重要作用。

根據衰老的自由基理論，正常代謝生物氧化副產物ROS能導致大分子的氧化損傷，并隨著年齡增長引起細胞功能障礙并最終導致細胞死亡。在本研究中，我們觀察到D-半乳糖引起小鼠的海馬中T-SOD和GSH-Px內源抗氧化酶活性的顯著失活，MDA（作為度量細胞或組織的氧化應激狀態的脂質過氧化產物）含量增加。而蘆丁能提高D-半乳糖誘導的衰老小鼠的抗氧化能力，這與其他報道一致[13]。這些發現表明蘆丁在一定程度上通過改善抗氧化防御系統的活性來消除因D-半乳糖引起的ROS超載。

星形細胞足突，作為血腦屏障的組成部分，在維持腦微環境的穩態中發揮重要作用。因此，星形膠質細胞是血流中ROS的第1道防線，其結構和功能改變可影響“神經膠質小體”的完整性并導致嚴重后果。星形膠質細胞的損傷與氧化應激誘導的腦衰老有關，累積標志物為GFAP。本研究顯示受D-半乳糖誘導的持續氧化應激的影響，小鼠中血管周圍星形細胞足突腫脹，結構和功能被破壞，GFAP陽性細胞數顯著增加，這些受損的星形膠質細胞通過上調NOS表達而產生NO，其水平也相應增加。從星形膠質細胞釋放的大量NO是神經毒性的，它通過多種信號途徑導致神經元損傷，在此基礎上，星形膠質細胞衍生的NO可能在這種衰老模型的發病機制中起關鍵作用[14]。然而，本研究證明蘆丁或維生素E的長期治療逆轉了D-半乳糖引起的NOS活性和NO水平的升高，表明蘆丁對腦損傷的保護作用可能與氧化應激的減弱有關。

總之，這項研究的結果表明，D-半乳糖誘導的模擬衰老和認知功能障礙與氧化應激的增加和由此引發的凋亡級聯導致的海馬神經元的損傷相關。蘆丁通過抑制神經細胞凋亡和保持樹突完整性，改善抗氧化防御系統的活性，緩解星形膠質細胞損傷來發揮明顯的神經保護作用，從而增強小鼠的認知能力。雖然確切的潛在機制仍不清楚，但本研究結果表明蘆丁可能在腦老化期間具有積極作用。