正天丸對偏頭痛模型大鼠三叉神經頸髓復合體c-f os、細胞外調節蛋白激酶表達的影響※

李 慧,白方會,伍志勇,吳艷華,陳寶田

(1.廣州市紅十字會醫院/暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院,廣東 廣州510220;2.河南省南陽市中心醫院,河南 南陽473003;3.南方醫科大學南方醫院,廣東 廣州510515)

偏頭痛是一種常見的原發性頭痛,表現為反復發作、單側或雙側,中重度搏動樣頭痛。流行病學資料顯示[1],我國偏頭痛的發病率為9.3%。2016年全球疾病負擔調查顯示偏頭痛致殘性在中國排第5位[2]。其發病機制尚未明確,但大量研究表明三叉神經血管系統的激活具有重要意義[3]。三叉神經頸髓復合體(TCC)是三叉神經二級神經元,當偏頭痛發作時TCC興奮性增高,進一步向中樞傳遞疼痛信號,最終導致偏頭痛。即刻早期基因c-f os是神經元激活的標志物,細胞外調節蛋白激酶(ERK)參與多種神經可塑性變化如痛覺的產生和維持,兩者在偏頭痛的發生中發揮了重要作用[4]。

《素問·痹論》說：“痛者寒氣多也,有寒故痛也。”辛溫藥能散能行,能祛風寒通氣血,通則不痛,故可止痛。正天丸是臨床治療偏頭痛的主要中成藥,其組成藥物多為辛溫之性。大量臨床研究和實驗研究表明,正天丸對偏頭痛止痛療效確切[5-7]。本研究擬通過觀察正天丸對硝酸甘油(NTG)誘發偏頭痛模型大鼠三叉神經頸髓復合體即刻早期基因c-f os、ERK表達的影響,以進一步探討正天丸對偏頭痛疼痛的防治機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠30只,體質量(280±20)g,由南方醫科大學實驗動物中心提供。動物飼養于清潔級動物房,12 h節律,室內溫度22～26℃,濕度40%～60%,自由攝取充足的水和飼料,實驗前適應性喂養7 d。實驗過程中對動物的處置遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.2 試劑及儀器 硝酸甘油注射液(北京益民藥業有限公司,國藥準字H11020289);正天丸(華潤三九醫藥股份有限公司,國藥準字Z44020711);10%水合氯醛(上海五聯化工廠);4%多聚甲醛溶液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);c-f os兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology);免疫熒光二抗-抗兔Cy3(南京凱基生物科技發展有限公司);p-ERK(Santa Cruz Biotechnology);β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司);BCA試劑盒和ECL發光液購于碧云天試劑有限公司;Sy BrI熒光定量試劑盒、MX3005P熒光定量PCR儀(Stratagene公司);IS 2000 MM圖像工作站(Kodak)。

1.3 造模與分組 按照隨機數字表法將SD大鼠隨機分為3組,每組10只,分別為空白組、模型組、治療組。治療組給予正天丸灌胃,劑量為1.62 g/(kg·d),按照成人常規口服量根據體表面積計算法換算;空白組和模型組大鼠給予相同劑量生理鹽水灌胃。各組大鼠連續給藥7 d。模型組、治療組大鼠末次灌胃30 min后通過左肩皮下注射硝酸甘油注射液(10 mg/kg)制備偏頭痛大鼠模型,空白組大鼠左肩部皮下注射相同劑量生理鹽水。造模4 h后取材。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 行為學觀察 偏頭痛大鼠造模成功表現為：耳朵發紅、前肢持續撓頭、頻繁爬籠、煩躁不安等。記錄指標：①記錄模型組和治療組大鼠造模后耳紅出現和消失時間;②將連續撓頭5次以上定義為持續撓頭,記錄模型組和治療組大鼠造模后持續撓頭出現和消失時間;③記錄每30 min大鼠爬籠次數,連續記錄3 h。

1.4.2 標本采集與指標檢測

(1)免疫熒光 各組大鼠造模4 h后,每組分別取5只行10%水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露心臟,剪開右心耳,4℃生理鹽水快速灌注至流出液清亮,4%多聚甲醛灌注固定。斷頭取延髓至上頸段脊髓(至第2頸椎),4%多聚甲醛固定,蔗糖脫水。石蠟包埋切片,片厚10μm。切片進行脫蠟和水化、熱抗原修復、滅火內源性過氧化物酶、封閉液封閉,加入一抗c-f os兔單克隆抗體(1∶200,#2250),過夜。滴加熒光二抗抗兔Cy3(Cat：KGIF010 1∶500),避光孵育1 h,PBS漂洗,加抗淬滅劑,中性樹膠封片,倒置熒光顯微鏡下觀察結果,紅色高亮為標記的c-f os。

(2)蛋白質印跡法(Wester n blotting) 造模4 h后,冰上取延髓至上頸段脊髓(至第2頸椎),-80℃液氮保存。將組織加液氮研磨后,加入150μL RIPA裂解液及1.5μL PMSF冰上孵育30 min,1 500 r p m 4℃離心15 min,取上清液,BCA法測定蛋白濃度。每個樣本各取50μg進行SDS-PAGE電泳,轉PDVF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST沖洗3次,加入一抗(1∶1 000),孵育過夜,HRP偶聯的山羊抗兔二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育l h,TBST沖洗3次,ECL化學發光法在IS 2000 MM成像系統(Kodak)進行曝光拍照,Molecular Imaging Soft ware Version 4.0(Kodak)軟件分析條帶灰度值,以β-actin作為內參。實驗重復3次,計算均值及標準差。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析,計量資料以均數±標準差±s)表示。方差齊時采用單向方差分析或t檢驗進行組間比較,方差不齊時采用Welch近似方差分析法進行組間比較;整體組間比較有差異時,進一步采用Bonferroni法(方差齊時用)或Dunnett′s T3法(方差不齊用)進行各組均數的多重比較,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學表現 空白組大鼠未出現耳朵發紅,無連續撓頭,偶有爬籠;模型組和治療組大鼠在造模后均出現雙耳發紅、持續撓頭及頻繁爬籠現象,提示造模成功。兩組耳紅出現和撓頭開始時間比較均無明顯差異,但治療組耳紅消失時間和撓頭結束時間均較模型組提前,持續時間較短。治療組在30 min后各時間段爬籠次數較模型組顯著降低。見表1、表2。

表1 兩組偏頭痛模型大鼠耳紅及持續撓頭時間比較(min,ˉ±s)

表1 兩組偏頭痛模型大鼠耳紅及持續撓頭時間比較(min,ˉ±s)

注：與模型組比較,△P＜0.01

組別 耳紅出現時間 耳紅消失時間 撓頭開始時間 撓頭結束時間治療組 3.96±0.17 102.79±2.38△ 4.01±0.19 102.43±2.39△模型組 3.88±0.27 132.55±3.78 3.86±0.21 134.41±11.74

表2 兩組偏頭痛模型大鼠各時間段爬籠次數比較(次±s)

表2 兩組偏頭痛模型大鼠各時間段爬籠次數比較(次±s)

注：與模型組同時間比較,△P＜0.01;與空白組同時間比較,▲P＜0.01

180 min治療組28.00±1.56▲ 18.10±1.52△▲11.9±1.37△▲ 9.10±1.37△▲ 3.90±0.74△▲ 2.20±0.63△組別 0～30 min 31～60 min 61～90 min 91～120 min 121～150 min 151～空白組 1.80±0.20 1.90±0.73 2.10±0.57 0.19±0.74 2.10±0.74 2.10±0.57模型組28.90±1.60▲ 23.10±2.02▲ 18.00±1.05▲ 12.90±1.79▲ 8.40±0.97▲ 4.20±1.48▲

2.2 免疫熒光結果 空白組、模型組和治療組大鼠三叉神經頸髓復合體內均有c-fos陽性表達(圖中紅色熒光顆粒),空白組表達量較少,模型組c-fos蛋白呈明顯高表達狀態,治療組表達亮度較模型組降低。見圖1(本期第109頁)。

2.3 Wester n bl otting結果 結果顯示p-ERK/ERK的比值分別為：空白組(0.67±0.01),模型組(0.97±0.03),治療組(0.77±0.00)。方差齊性檢驗結果顯示F=4.668,P=0.036,方差不齊,采用 Welch近似方差分析法進行組間比較,整體組間比較有差異(P＜0.01),進一步采用Dunnett′s T3法進行各組均數的多重比較,結果顯示模型組p-ERK/ERK較空白組明顯增加(F=82.666,P=0.004),治療組p-ERK/ERK受體蛋白表達較模型組明顯降低(F=82.666,P=0.006)。見圖2、圖3(本期第109頁)。

3 討論

偏頭痛是西醫病名,歸屬于中醫“頭痛”“偏頭風”范疇。傳統醫學對頭痛的病名、病因病機和治則描述可追溯至《黃帝內經》。《素問·五臟生成》曰“是以頭痛顛疾,下虛上實”。四氣五味是中醫基本藥性理論,“辛”作為五味之一,能散、能行,有發散、行氣、行血等作用。“溫”作為4種藥性之一,能散寒助陽。正天丸是全國名老中醫陳寶田教授在經方的基礎上結合自己多年的臨床經驗化裁得到,其大多數藥物為辛溫之藥。正天丸以川芎為君藥,味辛,性溫,具有活血祛瘀、行氣開郁、祛風止痛之功效。方中配麻黃、細辛、附子,能加強川芎活血行氣、祛風止痛之力。鉤藤息風定驚;白芍柔肝止痛;羌活祛濕止痛;獨活通痹止痛,用于少陰伏風頭痛;防風味辛,性溫,勝濕止痛,以上為臣藥,能加強川芎祛風散寒止痛之力。地黃養陰生津,當歸活血止痛,雞血藤活血通絡,桃仁活血化瘀,紅花散瘀止痛,皆為佐藥,以助川芎活血化瘀止痛。白芷祛風止痛,是正天丸中的佐使藥。作為治療偏頭痛的首選中成藥,正天丸的臨床療效得到廣大醫者和患者的好評[6-7],但其作用機制尚未明確。

近年來,越來越多的臨床和實驗研究表明,ERK在神經的可塑性變化如痛覺等的產生中發揮了重要作用[8]。磷酸化的ERK也是神經元被傷害性信息激活的標志物。實驗研究表明,ERK參與神經疼痛形成的可能機制是：慢性損傷促使p-ERK細胞核核內轉移,使其下游信號CREB磷酸化,改變目的基因c-f os的表達[9]。在通過大鼠皮下注射福爾馬林導致的急性疼痛模型中,三叉神經脊束核存在客觀數量p-ERK的表達,說明了ERK是三叉神經脊束核傳導傷害性刺激的介質[10]。在硝酸甘油導致的偏頭痛大鼠模型中,活化的肥大細胞誘發了延遲性痛覺過敏[11],同時可以導致p-ERK在三叉神經脊束核表達增加,也和偏頭痛發作時的神經源性炎癥反應和中樞性致敏反應相關[12]。本研究結果顯示：模型組大鼠TCC中p-ERK的表達較正常空白組明顯增加,說明給予NTG皮下注射后,激活了TCC的ERK信號通路,再次驗證了ERK的磷酸化參與了偏頭痛發作過程中的痛覺信息傳遞。治療組的p-ERK表達較模型組降低,表明抑制ERK信號的活化也可能是正天丸治療偏頭痛的作用機制之一。

c-f os既是ERK信號通路的下游因子,也是傷害性信息激活神經元的標志物[13]。在本研究中,硝酸甘油偏頭痛模型大鼠的三叉神經頸髓復合體呈明顯高表達狀態,對c-f os蛋白水平的檢測間接的反映出三叉神經感覺神經元的激活狀態。本研究的結果顯示硝酸甘油皮下注射4 h后,c-fos在偏頭痛大鼠三叉神經頸髓復合體內呈明顯陽性表達,表明三叉神經感覺神經元成功激活。有文獻報道應用硝酸甘油4 h后,三叉神經脊束核尾側部,中腦導水管周圍灰質、視上核、室旁核等感受痛覺信息的相關腦區均可見c-fos的明顯陽性表達[14],更進一步支持了我們結果的可靠性。正天丸可以抑制三叉神經血管系統感覺神經元的激活。

綜上所述,三叉神經頸髓復合體中ERK表達上調參與了偏頭痛的發作,辛溫止痛法正天丸可以通過降低偏頭痛模型大鼠三叉神經頸髓復合體內c-f os、ERK的過表達,達到減輕偏頭痛疼痛的作用,為其臨床療效提供了有力的理論依據。但偏頭痛的發病機制涉及面廣,正天丸對其他神經遞質的影響有待進一步研究。