大鼠腦缺血再灌注損傷后HMG-COA還原酶抑制劑下調Caveolin-1表達對血腦屏障的影響

王 也 馮新紅 畢國榮 武 劍

清華大學附屬北京清華長庚醫院 清華大學臨床醫學院，北京 102218

急性腦梗死是一個復雜的病理生理過程，包括缺血期原發性損傷和再灌注期的繼發性損傷，其機制與自由基損傷機制、細胞內鈣離子超載機制、興奮性氨基酸機制、一氧化氮和炎癥反應機制等。中樞神經系統錯綜復雜，隨著近年來醫學界對其多種細胞的形態及功能的進一步認識，對腦梗死后神經損傷機制和作用靶點的研究取得一定進展，但仍然存在許多盲點。長期以來缺血性卒中的防治研究大多局限于神經元本身，忽略了神經系統的整體性和不同結構間的相互作用[1]。2002年，美國神經疾病與卒中研究所首次提出了神經血管單元(neurovascular unit，NVU)的概念，此概念強調組成NVU的神經元、膠質細胞和血管成份必須作為一個多類型細胞構成的復雜結構和功能體系[2]。中樞神經系統的血管結構中有一個重要特點是形成血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，其構成包括腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)、基底膜和星形膠質細胞的血管周足，其成員的交集使得NVU的內涵還包括BBB。

BBB是一種保護性生物膜屏障，主要將中樞神經系統與外界分隔。決定其通透性的主要因素是細胞旁路與跨細胞途徑。細胞旁路途徑主要由緊密連接(tight junction，TJ)介導；跨細胞途徑主要由內源性的運載體介導，主要包括4類：載體介導的運載體(CMT)/主動運出的運載體(AET)/受體介導的運載體(RMT)，以及Caveolae主導的細胞吞、胞飲和穿胞吞排作用[3]。

Caveolae——胞膜窖/細胞質膜微囊于19世紀50年代發現，是細胞膜表面的富含膽固醇、鞘磷脂和鞘糖脂的特異性疏水內陷結構，形狀50～100 nm的“Ω”樣或者燒瓶結構。目前已知Caveolae在哺乳動物中廣泛存在于各種類型細胞中，尤其在內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞等最為豐富。其參與受體介導轉運小分子(胞飲作用)，以及參與多種細胞調節作用，比如信號轉導、細胞生長、細胞凋亡以及脂類代謝等。Caveolins是Caveolae的主要結構蛋白及標記蛋白，包含3個成員：Caveolin-1、Caveolin-2及Caveolin-3。Caveolin-1及Caveolin-2多存在于脂肪、內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、肺組織等中，Caveolin-3主要存在于心肌、骨骼肌、橫紋肌中，本研究致力于中樞神經系統存在的Caveolin-1蛋白。

國際上對于腦缺血再灌注后中樞神經系統Caveolin-1的研究已經開展了多年，有報道稱敲除Caveolin-1基因的大鼠BMECs通透性升高[4]且缺血再灌注后出現的梗死體積更大[5-6]，根據目前報道文獻其機制可能通過：(1)Caveolin-1調控NOS演化階段調控NO表達影響NO的信號通路：一方面，NO可以從mRNA及蛋白角度下調Caveolin表達；另一方面，Caveolin-1可使NOS所有的3個亞型失活來下調NO水平[7]。有文獻報道，Caveolin-1對NO調節構成了正反饋作用，能夠使NO在腦缺血后都持續上升。NO是把“雙刃劍”同時具備損傷保護的雙重作用，在I/R早期內皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達合成適量的NO保護腦組織，還能降低血小板的聚集力、抑制白細胞的黏附、擴張血管和增加腦血流等作用；亞急性期時除了eNOS外還有神經型一氧化氮合酶(nNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達，會產生高濃度的NO與氧自由基反應生成氧合超氧化氮陰離子(ONOO-)和羥自由基(RNS)破壞BBB[8-9]。(2)Caveolin-1藉由NO下調基質金屬合酶(MMPs)表達，目前國內外針對MMPs表達的報道較多，在腦缺血再灌注損傷急性期各類型的MMPs前體均被NO介導的“半胱氨酸開關”前體區域的S-亞硝酸化作用將前體激活，或NO產生的過氧化亞硝酸鹽自由基刺激下直接斷裂“半胱氨酸開關”，激活MMPs[10]，上調各類型的MMPs表達。尤其MMPs-2和-9的過表達會降解腦基質、破壞緊密連接蛋白、加重腦水腫和出血轉化風險，并導致血管神經單元中的BBB出現雙期開放——第一時相開放與MMP-2活化有關[11-12]，而第二時相開放與MMP-9活化有關[13]。

目前存在一個有趣的現象是相當數量的文獻報道I/R后Caveolin-1蛋白的表達水平存在明顯矛盾，GU等[8]及SHEN等[7]闡述腦缺血再灌注后Caveolin-1表達降低，然而NAG等[14]及JEAN-FRAN等[15]研究結論則是大鼠腦MCAO模型后Caveolin-1表達大幅度增加，且這兩種觀點中對Caveolin-1這一蛋白對BBB的角色描述也是截然相反的。對這一現象的解釋尚不明確，可能是由于實驗條件不同，因此還需要進一步的實驗研究血腦屏障和Caveolin-1的關系。

他汀類藥物(statins)即3-羥基3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydro2xy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，是一類強效降膽固醇藥物，具有安全性高、耐受性好等優點。大量實驗和臨床研究表明，他汀具有調控血脂、穩定動脈粥樣硬化斑塊、預防卒中的復發等作用。以往的報道中證實他汀能降低心血管內Caveolin-1的表達[16]，且這一過程與調脂無關[17]，目前顱內段血管研究尚少。由于辛伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀相對親脂性強，可透過血腦屏障，本實驗選擇辛伐他汀作為預處理，擬定給以不同劑量辛伐他汀預處理與生理鹽水組比較，進一步研究給以不同劑量HMG-COA還原酶抑制劑預處理后，被不同程度下調的Caveolin-1對血腦屏障通透性的作用。

1 材料與方法

1．1實驗動物準備及分組SPF級雄性大鼠適應性喂養1周后，隨機分成辛伐他汀低劑量組[3 mg/(kg·d)]、中等劑量組[6 mg/(kg·d)]、高劑量組[10 mg/(kg·d)]、生理鹽水缺血組、假手術組。給藥組將辛伐他汀溶于生理鹽水按0.67 mL/100 g灌胃使個組給液體量相當，生理鹽水組及假手術組采用同等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，連續7 d，最后一次灌胃3 h后造模。

1．2MCAO模型制備將傳統MCAO線栓法加以改進，以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射給藥麻醉。分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)。結扎ECA，電凝離斷頸外動脈后顯微剪口，將線栓由ECA剪口插入CCA分叉，線栓繼續進入ICA，當遇到輕微阻力時停止，此時線栓插入深度為18～20 mm。2 h后再灌，將大鼠再次麻醉，剪開切口縫合線，將魚線抽出5 mm，此時MCA血流再通。假手術組僅結扎ECA后縫合。

1．3神經功能評分參照Zea Longa 5分制評分標準，進行評定。0分：無神經損傷癥狀；1分：對側前爪不能完全伸直；2分：行走時向對側轉圈；3分；站立不穩，向對側傾倒；4分：不能自發行走；意識喪失。術后約1 h動物可蘇醒，觀察神經功能缺失情況。累計2分或2分以上即為成功模型。

1．4干濕質量法測腦含水量每組取7只大鼠，斷頭取腦組織，以視交叉前2 mm和乳頭體為標志冠狀切為前、中、后三段，每段分為健側和患側，萬分之一電子分析天平秤取腦濕質量，置于100 ℃烤箱中烘烤至恒重(即2次測量質量相同)時秤取腦干質量，按公式：腦組織含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%，測算出腦組織的含水量百分比。

1．5伊文思藍滲透法梯度配制標準品：EB 4.73 mg加入生理鹽水至25 mL，取0.3 mL加入5.7 mL二甲基甲酰胺混勻為第一管，從第一管中取出3 mL加入3 mL二甲基甲酰胺為第二管，第二管對比稀釋為第三管，依次類推共7管，濃度依次為9.46、4.73、2.37、1.18、0.591、0.296、0.148 μg/mL。置于分光光度計(波長620 nm)測光密度OD值(以蒸餾水作空白比色)。以濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，帶入數據求得回歸方程：Y=A×X+B。每組取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后，經股靜脈注射EB(生理鹽水配至2 mL/kg)，2 h后斷頭取腦。取其中5只，左右大腦半球分開稱質量，每克腦組織加入2 mL甲酰胺后，置于50 ℃恒溫水浴箱，加蓋遮光水浴72 h，然后3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于分光光度計(波長620 nm)測光密度OD值(以蒸餾水作空白比色)。

1．6TTC染色法測定梗死體積每組取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后，經左心室迅速灌注PBS 150 mL，快速斷頭取腦，將腦切成2 mm厚，放于4% TTC染液中，37 ℃溫育15 min。TTC僅能被線粒體功能正常的細胞攝取，因此梗死區不著色，正常腦細胞染成橘紅色，用圖像處理軟件(Photoshop)磁性套索像素比例計算梗死面積(橘紅色區域為正常腦組織，白色區域為梗死區)、各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死容積。梗死體積百分率=(正常側大腦半球體積-梗死側非梗死區腦組織體積)/正常側大腦半球體積×100%。

1．7WesternBlot分析每組隨機取5只大鼠，冰上操作腹主動脈放血處死后，迅速取腦存入液氮罐轉存于-80 ℃冰箱中。按TTC試驗中所示的梗死部位取梗死側腦皮質100 mg，置于1.5 mL EP管內放入冰盒中，PBS清洗后加RIPA 800 μL，剪刀剪碎后超聲，低溫離心(4 ℃，1 400 r/min，30 min)，取上清做BCA蛋白定量(1∶10及1∶100比例)，測得吸光度、上樣濃度及曲線。取上清100 μL加入上樣緩沖液后蛋白變性(100 ℃，10 min)。制膠后每泳道上樣8 μL，彩虹Marker 5 μL。濃縮膠80 V，分離膠120 V恒壓電泳至溴酚藍溢出為止，100 V恒壓轉膜1 h，脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗5 min×3次，一抗(兔大鼠抗體Caveolin-1，Santa Cruz)、GAPDH(1∶2 000)封閉16 h。取出膜后TBST清洗5 min×3次，二抗(山羊抗兔1∶2 000)結合2 h，TBST清洗5 min×3次，ECL發光。蛋白條帶光密度分析，半定量結果=目標蛋白條帶光密度/GAPDH蛋白條帶光密度。

1．8免疫組化分析每組隨即取8只大鼠，以10%水合氯醛麻醉后，大鼠沿胸骨左側剪開胸腔，從左心室進針，插入到主動脈，固定針頭，剪開右心耳，快速滴入預冷生理鹽水200 mL，無血污后改滴入冷4%多聚甲醛200 mL后斷頭取腦，取缺血側大腦半球中1/3，置4%多聚甲醛固定48 h，過缸后制成石蠟切片，切片浸入0.01 mol/L EDTA，高壓鍋加熱至沸騰，蓋加壓閥高壓7 min，室溫冷卻20 min；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加抗Caveolin-1大鼠抗體(兔大鼠抗體Caveolin-1，Santa Cruz)，4 ℃冰箱過夜，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；加入兔抗大鼠IgG抗體-HRP多聚體二抗，室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加DAB顯色劑至顯微鏡下出現著色清晰、境界明確的棕黃色陽性產物，1～2 min蒸餾水充分沖洗，蘇木素復染1 min，自來水中止反應；1% HCl酒精分化20 s，自來水洗1 min；氨水返藍30 s，自來水洗1 min；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。同時用PBS代替一抗作空白對照以檢查免疫反應的特異性。

2 結果

2．1神經功能評分各組大鼠在造模成功后，均進行神經功能評分并記錄20只得分情況，觀測得分示全部辛伐他汀預處理組明顯優于生理鹽水缺血組(P<0.01)。見表1。各組方差分析F=5.716，P=0.001，給予不同劑量他汀預處理對神經功能評分影響差異有統計學意義。

2．2干濕質量法測腦含水百分比檢測BBB通透性依據公式計算干濕質量百分率，結果顯示，全部預處理組濕質量明顯小于生理鹽水缺血組(P<0.05)，且各預處理組間兩兩比較發現中劑量組濕質量小于高劑量組(t=5.092，P=0.024<0.05)。見表2；各組方差分析F=8.824，P=0.01，給予不同劑量他汀預處理對腦組織中水含量百分比差異有統計學意義。

表1 各組神經功能評分比較

注：各預處理組與缺血組相比，**P<0.01

2．3伊文思蘭滲透法檢測BBB通透性使用梯度法配制標準品后，用分光廣度計測取OD值，根據梯度濃度算得A=0.0275，B=0.0616，C=0.787，將數據帶入方程Y=A×X+B，獲取公式Y=0.0275×X+0.0616。測伊文思藍滲透OD值結果，各給藥組伊文思藍滲透水平均低于生理鹽水組(P<0.05)，各預處理組兩兩比較低劑量組優于中及高劑量組(P<0.05)，且中劑量組優于高劑量組(P<0.05)。見表3。各組方差分析F=140.916，P=0.000，給予不同劑量他汀預處理對腦組織中EB含量影響差異有統計學意義。

2．4TTC染色TTC染色結果顯示，假手術組未見任何梗死，所有低劑量及中劑量的預處理給藥組梗死體積百分比明顯小于生理鹽水組(P<0.01)，高劑量組未見優勢反出現梗死體積變大，各劑量預處理組間兩兩比較低及中劑量組梗死體積均小于高劑量組(P<0.05)，見圖1、表4。各組方差分析F=12.455，P=0.000，給予不同劑量他汀預處理對腦組織梗死體積百分比影響差異有統計學意義。

2．5梗死半球皮質部位Caceolin-1表達情況Western blot使用目的條帶與對應內參GAPDH灰度的比值做定量分析，結果顯示，各預處理組Caceolin-1表達水平均低于生理鹽水缺血組(P<0.05)，生理鹽水缺血組Caceolin-1水平明顯增高，且高于假手術組，各給藥組兩兩比較發現隨劑量增加Caveolin-1被降低水平增加，即低劑量<中劑量(P<0.05)和中劑量低于高劑量(P<0.05)，各預處理組與假手術組分別對比結果Caveolin-1表達水平均降低(P<0.05)。見圖2。

2．6各組梗死半球皮質微血管段Caceolin-1表達情況免疫組化示Caveolin-1蛋白在各組大鼠腦組織中均沿微血管陽性表達(圖3)，免疫組化染色半定量測量分布于血管內皮的Caveolin-1表達，與Western blot分析結果大概一致，全部預處理組表達水平均低于與生理鹽水缺血組(P<0.05)，各劑量給藥組兩兩比較，高及中劑量組少于低劑量(P<0.05)，中與高劑量之間差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組腦含水量百分比比較

注：各預處理組組與生理鹽水缺血組相比，*P<0.05，**P<0.01；中劑量組與高劑量組相比，$P<0.05

表3 各組腦Evans藍含量比較

注：各預處理組與缺血組相比，**P<0.01

圖1 按劑量組顯示出白色梗死區域 A：假手術組未見任何梗死；B：鹽水缺血組梗死體積最大；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組未見優勢反出現梗死體積變大Figure1 White infarct area by dose group A：no infarction in sham operation group；B：infarct volume in saline ischemia group；C：low dose group；D：middle dose group；E：high dose group has no advantage inverse infarct volume becomes larger

圖2各組Caveolin-1蛋白表達情況(n=5)A：M為ProteinLadder，A1～A5依次為假手術組、生理鹽水缺血組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，其中A2表達情況明顯高于A3～A5；B：B1～B5依次為假手術組、生理鹽水缺血組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，B3～B5分別與B2兩兩相比，獨立樣本t檢驗，表達明顯降低，**P<0.05

Figure2The expression of Caveolin-1protein in each group (n=5) A：M is Protein Ladder，and A1-A5are sham operation group，normal saline ischemia group，low dose group，middle dose group and high dose group.The expression of A2was significantly higher than that of A3-A5；B：B1-B5were sham operation group，normal saline ischemia group，low dose group，middle dose group and high dose group，and B3-B5were compared with B2.Independent sample t test，the expression was significantly reduced，**P<0.05

表4 各組腦梗死體積百分比比較

注：各組與生理鹽水缺血組相比，**P<0.01，##P>0.05；低與中劑量組分別與高劑量組相比，$P<0.0.5

圖3 各組中微血管Caveolin-1蛋白表達情況(n=8) A：A1～A5依次為假手術組，生理鹽水缺血組，低劑量組，中劑量組及高劑量組，其中生理鹽水缺血組表達情況明顯高于其他各組；B：B1～B5依次為假手術組，生理鹽水缺血組，低劑量組，中劑量組及高劑量組Figure3 Expression of microvascular Caveolin-1protein in each group (n=8) A：A1-A5were sham operation group，normal saline ischemia group，low dose group，middle dose group and high dose group，in which saline deficiency The expression of blood group was significantly higher than that of other groups；B：B1-B5were sham operation group，saline ischemia group，low dose group，middle dose group and high dose group

3 討論

目前國際上對于中樞神經系統Caveolin-1的研究已經開展了多年，但對于腦I/R損傷后Caveolin-1的表達情況及Caveolin-1對BBB的作用和預后卻得到了孑然相反的結論，GU等[8]以及SHEN等[7]發表的文章中闡述腦缺血再灌注后Caveolin-1表達降低，然而NAG等[14]研究證實在缺血缺氧后Caveolin-1的表達增加和JEAN-FRAN等[15]證實大鼠腦MCAO模型后Caveolin-1表達大幅度增加。針對這一現象，研究中給以大鼠MCAO模型，通過免疫組化及Western Blot兩種蛋白定量手段比較假手術組及生理鹽水缺血組的缺血半球皮層微血管段及皮層區Caveolin-1表達，發現在腦缺血2 h再灌注24 h損傷后的大鼠腦內的其表達明顯增加，并將Western Blot檢測的時間點延續至缺血2 h再灌注48 h、72 h及1周發現，缺血后Caveolin-1表達持續增加與48 h達高峰，隨后的72 h及1周表達量逐漸下降，選取腦梗死中心組織均定位于同組TTC實驗中呈現白色的梗死部位，即梗死側半球中后1/3的皮層。對于本研究結論與已有報道中矛盾部分，可能是由于實驗條件不同，如大鼠的年齡、缺血持續的時間、實驗的免疫分析中對整個缺血半球或者僅對缺血中心的組織進行勻漿等原因。

HMG-CoA還原酶抑制劑是一類強效降膽固醇藥物，具有安全性高、耐受性好等優點。大量實驗和臨床研究表明，他汀具有調控血脂、穩定動脈粥樣硬化斑塊、預防卒中的復發等作用。以往研究中證實他汀能降低心血管內Caveolin-1的表達[16]，這一過程可能與增加腦源性神經營養因子(BDNF)、血管內皮生長因子(VEGF)的表達有關，可以促進缺血后神經功能的恢復，但這一過程與血清膽固醇水平無關[17]，目前顱內段血管的研究尚少。我們采用易通過血腦屏障的辛伐他汀給予大鼠預處理對比生理鹽水缺血及假手術組，給以MCAO造模后對梗死中心蛋白定量。本研究證實與心血管內報告的結果一致，他汀類對神經系統中微血管內Caveolin-1表達同樣抑制作用，其效果使腦缺血2 h再灌注24 h損傷中本應增加的Caveolin-1表達明顯降低，甚至其抑制后的程度低于生理狀態下，且3個劑量組兩兩對比發現，隨給藥劑量增加，Caveolin-1被抑制的水平也增加。

近年來，隨著分子生物學進展，越來越多的證據說明TJ在BBB完整的結構及功能中扮演十分重要的角色，其構成包括結合黏連分子(junctional adhesion molecule，JAM)、ccludin、claudin和ZO蛋白等。在I/R損傷中，BBB的開放途徑之一即是由TJ介導的細胞旁路途徑，一方面，SONG等研究指出在大鼠的腦缺血再灌注模型中已Caveolin-1能通過下調MMPs蛋白表達保護緊密連接蛋白，使用siRNA轉染沉默Caveolin-1表達的大鼠腦BMECs中緊密連接蛋白會缺失、重排，導致血腦屏障通透性增加和單核細胞移動穿過BBB血管內皮結構[18]；另一方面，NAG等[14]的研究表明，Caveolin-1會降低緊密連接蛋白的穩定性，導致其組分重排，并直接下調occludin、claudin和ZO-1等的表達[19]。在BBB的開放途徑另一途徑——跨細胞途徑中，Caveolin-1的表達情況會直接作用于由其構成的Caveolae，Caveolae是跨細胞途徑中主導的胞吞、胞飲和穿胞吞排作用的[3]重要膜結構。BBB通透性增加會加重腦水腫，這也是腦I/R損傷后腦損害的重要一環。生理狀態下的BBB能夠完全阻止大分子染料伊EB滲透進入腦組織，而在I/R損傷后，BBB的開放會使EB沿微血管管壁彌散進入腦組織。研究[20]證實，腦損害1 h內損害側EB含量增加，24 h可達高峰。本研究使用干濕質量、EB通透性兩種手段測定I/R損害后24 h梗死腦組織，評價不同組別的BBB破壞情況，證實假手術組BBB功能完好OD值遠低于其他所有組，生理鹽水缺血組BBB通透性最高，不同劑量給藥組對BBB保護作用兩兩比較中，兩種實驗方法均證實中劑量組優于高劑量組，EB滲透實驗中低劑量組優于中劑量組，這一現象與TTC實驗的結果一致，即高劑量辛伐他汀組中Caveolin-1的表達被過度抑制，此過程會導致BBB的通透性增加。

4 結論

I/R中Caveolin-1蛋白的表達水平會增加，并影響BBB的通透性。在中樞神經系統中HMG-COA還原酶抑制劑對Caveolin-1的作用與其在心血管中的效果一致，能夠有效降低Cavolin-1表達，且抑制程度與劑量水平相關。Caveolin-1過表達或低表達都會增加腦缺血再灌注后的損害，在MCAO中給予適當劑量辛伐他汀可以通過抑制過表達的Caveolin-1，保護血腦屏障完整，但過高或過低水平Caveolin-1蛋白都會破壞血腦屏障，增大梗死的體積，針對這一現象可以在缺血48 h內，有針對的，在其表達上升階段，給以適量的他汀，適度降低Cavolin-1以減少腦損害。

本研究有針對性地面向國際相關文獻中記載的矛盾部分設計實驗，探索解決尚未解決的相關問題，可惜并未對Caveolin-1參與NO通路及藉由NO通路形成多通路串聯中探討Caveolin-1的角色，能說明的問題仍十分有限，對其作用機制仍有待進一步研究。