一株用于石油污染修復的產漆酶菌種產酶條件優(yōu)化及性能評價

宋佳宇，李興春，于文赫，吳百春

(1.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206；2.中國石油集團安全環(huán)保技術研究院有限公司，北京 102206)

1 引言

隨著石油石化行業(yè)的發(fā)展，土壤石油污染問題日益突出，石油污染物因具有結構穩(wěn)定、不易降解、“三致”等[1]特點已成為影響土壤安全利用的重要因素之一。酶是具有生物催化活性的一類物質，石油降解酶類對土壤中有機物具有活化或抑制分解等作用[2]。近年來，酶修復技術已在石油污染修復領域得到廣泛關注[3]。

漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)，又名酚酶、多酚氧化酶、漆酚氧化酶等，是一類含銅的糖蛋白氧化酶[4,5]，對酚及其衍生物[6]、芳胺及其衍生物[7]等污染物具有較強的催化效果。因其具有底物選擇性廣泛和穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，漆酶在環(huán)境污染修復領域[8,9]應用前景廣闊。然而，漆酶大多屬于胞內酶，提取效率極低，純化成本較高，嚴重制約了其在實際污染治理中的應用[10～12]。

據(jù)此，本研究選取可胞外產漆酶的血紅密孔菌Pycnoporus coccineus(PC)為產漆酶菌種，通過優(yōu)化產漆酶培養(yǎng)基條件及培養(yǎng)環(huán)境條件，獲取漆酶最佳液體發(fā)酵工藝參數(shù)，制備出高效石油降解粗酶制劑并開展原油降解效果評價，為漆酶制劑的工業(yè)化生產和現(xiàn)場應用提供技術參數(shù)。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 產漆酶菌種

本研究所用的產漆酶菌種為血紅密孔菌(Pycnoporus coccineus，PC)，取自日本某菌種保藏中心。

2.1.2 石油降解菌群

本研究所用石油降解菌群為本實驗室保存的高效石油烴降解復配菌群[13]，由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，GenBank登錄號：Z76651)、彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus，GenBank登錄號：AB021185)和蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus，GenBank登錄號：AE016877)按1∶1∶1(V∶V∶V)比例復配而成。該復配菌群10 d內對實驗用原油(約10000 mg/L)的總石油烴(Total Petroleum Hydrocarbons,TPHs)降解率達58.24%。

2.1.3 培養(yǎng)基配方

基礎產酶培養(yǎng)基：葡萄糖 20.00 g，硫酸銨 2.64 g，苯甲基丙氨酸 0.15 g，腺嘌呤 0.028 g，硫胺素50.00 μg，KH2PO41.00 g，Na2HPO4·2H2O 0.10 g，CaCl20.01 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，ZnSO4·7H2O 0.0010 g，MnSO4·4H2O 0.0010 g，CuSO4·5H2O 0.0020 g，蒸餾水1000 mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[14](PDA 固體培養(yǎng)基)：馬鈴薯200.00 g切成小塊，加蒸餾水煮沸，冷卻后用四層紗布過濾，將濾液裝入1000 mL容量瓶。隨后加入瓊脂17.00 g，葡萄糖20.00 g，加熱攪拌混勻，稍冷卻后用蒸餾水定容至1000 mL。

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g，瓊脂2.00 g，蒸餾水1000mL，調整pH值6.5～7.5。

微量元素液：MgSO425.00 g、CuSO41.00 g、MnSO41.00 g、FeSO4·7H2O 1.00 g、蒸餾水500mL。

無機鹽培養(yǎng)基：NH4Cl 2.00 g、NaNO31.00 g、KH2PO41.00 g、K2HPO42.50 g、NaCl10.00 g、微量元素液5 mL、2%CaCl2溶液0.5 mL、蒸餾水1000 mL。

含油培養(yǎng)基：移取1.00 g原油至已滅菌的150 mL錐形瓶，加入50 mL無機鹽培養(yǎng)基即得。

以上培養(yǎng)基/液使用前均需經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min后方可使用。

2.1.4 原油

本研究所用原油取自某油田，其動力粘度為282.7 mPa·s，相對密度為0.971 g/cm3。原油中飽和烴、芳香烴、瀝青質、膠質的質量分數(shù)分別為：16.22%、55.21%、4.24%和15.77%。

2.2 試驗方法

2.2.1 產漆酶菌種活化

挑取少量冷凍保藏的PC菌菌絲接種于 PDA 固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后，挑出長勢較好的菌體轉接到50 mL基礎產酶培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2 d，即為產漆酶菌種母液[15]。

2.2.2 粗酶液的制備

取一定量產漆酶菌種母液在4 ℃，8000 r/min條件下離心10 min，取上清液。將上清液透析除鹽后，即得到粗酶液。

2.2.3 漆酶酶活測定

漆酶可以催化2,2’-連氮-二-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)發(fā)生氧化反應[16,17]，生成的氧化型ABTS在420 nm處產生強吸收峰。據(jù)此，本研究以漆酶對ABTS的氧化速度作為漆酶酶活的評價指標。具體步驟[18]如下：在30 ℃水浴條件下，將緩沖液(1.9 mL 0.1 mol/L HAc/NaAc (pH=4))和粗酶液加入試管中，加入1 mL ABTS，使其工作濃度為1 mmol/L，開始計時。利用分光光度計檢測在420 nm波長條件下反應3 min時的吸光值，所有反應設3個平行。1 min催化1 umol的ABTS消耗掉的酶為1個酶活力單位(U)。

2.2.4 蛋白含量測定

采用馬斯亮藍法[19]測定蛋白含量。在595 nm處測定標準蛋白以及樣品溶液的吸光值，根據(jù)標準蛋白吸光度衡量樣品的蛋白含量。計算公式為：

2.2.5 產酶培養(yǎng)基條件對漆酶活性的影響

(1)不同碳源對漆酶活性的影響。分別以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、淀粉、羧甲基纖維素鈉為產酶培養(yǎng)基替代碳源，保持培養(yǎng)基其他成分不變，在30 ℃、175 r/min條件下培養(yǎng)5 d后測定漆酶活性。所有試驗均重復3次。

(2)不同氮源對漆酶活性的影響。分別以5 g/L的硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉和硝酸鉀為基礎產酶培養(yǎng)基替代碳源，保持培養(yǎng)基其他成分不變，在30 ℃、175 r/min條件下培養(yǎng)5 d后測定漆酶活性。所有試驗均重復3次。

(3)不同磷源對漆酶活性的影響。分別以2 g/L的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀及復合磷源(磷酸二氫鉀與磷酸氫二鈉質量比為10∶1)為基礎產酶培養(yǎng)基替代磷源，保持培養(yǎng)基其他成分不變，在30 ℃、175 r/min條件下培養(yǎng)5 d后測定漆酶活性。所有試驗均重復3次。

(4)銅離子對漆酶活性的影響。設置銅離子(無水硫酸銅)濃度梯度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mmol/L，保持培養(yǎng)基其他成分不變，在30 ℃、175 r/min條件下培養(yǎng)5 d后測定漆酶活性。所有試驗均重復3次。

(5)不同誘導劑對漆酶活性的影響。在產酶菌體生長第二天分別添加誘導劑咔唑、萘酚、芘、蔥至產酶培養(yǎng)基中，誘導劑添加濃度均為2×10-4mmol/L，在30 ℃、175 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d后測定漆酶活性。所有試驗均重復3次。

2.2.6 培養(yǎng)環(huán)境對漆酶活性的影響

以漆酶活性為評價指標，保持最佳產酶培養(yǎng)基成分不變，針對初始pH值、溫度、搖床轉速和接種量4個變量開展培養(yǎng)環(huán)境對漆酶活性影響因素研究。所有試驗均重復3次。

2.2.7 粗酶液對微生物原油降解速率的影響

分別將5 mL過夜培養(yǎng)的復合制劑(粗酶制劑+菌劑，體積比1∶1)及單一制劑(石油降解菌液)置于30 mL原油培養(yǎng)基中，在30 ℃，175 r/min下培養(yǎng)。每隔48 h測定原油濃度變化情況，選用二氯甲烷(色譜級，4L)為萃取液，利用重量差值法[20]計算殘油量，連續(xù)測試18 d。所有試驗均重復3次。

3 結果與討論

3.1 基礎產酶培養(yǎng)基中產漆酶的一般過程

本研究對PC菌在基礎產酶培養(yǎng)基上產漆酶歷程進行研究，經(jīng)過144 h的培養(yǎng)，漆酶活性及蛋白含量隨時間變化曲線如圖1所示。由圖1可知，培養(yǎng)前期(0～60 h)PC菌漆酶活性及蛋白含量均較低，分別為4.10±0.89 U/L和0.25±0.092 mg/L，這主要是由于大部分產漆酶真菌在培養(yǎng)的初始階段僅為菌體的生長而并未分泌漆酶，漆酶作為次生代謝產物[21]，大量生成主要集中在培養(yǎng)的第二階段，故真菌產胞外漆酶的產酶周期一般較細菌長。進入培養(yǎng)中期(72～120 h)后，漆酶活性及蛋白含量均迅速增加，并均在120 h達到最大值，分別為118±10.33 U/L和1.49±0.55 mg/L，表明PC菌進入迅速增長期，且產生的蛋白大多為漆酶蛋白。進入培養(yǎng)后期(132～144 h)，漆酶活性及蛋白含量均呈迅速下降趨勢，分別由79.33±8.24 U/L降至38.24±5.42 U/L和1.02±0.42 mg/L降至0.35±0.13 mg/L，這主要是由于隨著菌體生長代謝，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分大量消耗，導致菌劑生長受到抑制，漆酶活性及蛋白含量大幅下降。據(jù)此，確定60 h(5 d)為PC菌最優(yōu)培養(yǎng)時間。該結論與王蕾等[22]、李環(huán)明等[23]的研究結果一致。

3.2 培養(yǎng)基條件對漆酶分泌的影響

產酶培養(yǎng)基組成對真菌分泌漆酶的影響較大，主要影響因子為碳源[24]、氮源[25]、誘導物[26,27]等。據(jù)此，本研究選取碳源種類、氮源種類、磷源種類、Cu2+濃度及抑制劑種類5個指標開展單因素條件實驗，對其產漆酶培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。

由圖2(a)可知，復雜碳源(羧甲基纖維素鈉和淀粉)對PC菌分泌漆酶的影響顯著高于簡單碳源(葡萄糖和蔗糖)，其中，以羧甲基纖維素鈉作為替代碳源時漆酶活性最高，達399.37 ±5.99 U/L，約為基礎產酶培養(yǎng)基的3.70倍。據(jù)此，選取羧甲基纖維素鈉作為產酶培養(yǎng)基最優(yōu)替代碳源。

圖1 漆酶活性及蛋白含量隨時間變化曲線

由圖2(b)可知，除硝酸氨外，其他氮源均對漆酶分泌產生了促進作用，影響最為顯著的是硝酸鈉，達到了320±10.25 U/L。據(jù)此，選取硝酸鈉作為產酶培養(yǎng)基最優(yōu)替代氮源。

由圖2(c)可知，不同種類的磷源均對漆酶分泌有促進作用，其中磷酸氫二鉀對漆酶分泌影響較為明顯，達到了387±3.77 U/L。據(jù)此，選取磷酸氫二鉀作為產酶培養(yǎng)基最優(yōu)替代磷源。

由圖2(d)可知，當培養(yǎng)基中Cu2+初始濃度為1.0 μmol/L時，漆酶活性最高，達190.59±10.14 U/L。但隨著Cu2+濃度持續(xù)增加，漆酶活性逐漸下降。當Cu2+濃度達到4.0 umol/L時，漆酶活力顯著下降至54.45±5.33 U/L。據(jù)此，在PC菌發(fā)酵產漆酶的過程中，Cu2+的濃度應控制在1.0 μmol/L。

由圖2(e)可知，在各類誘導物均對漆酶的分泌具有較強的促進作用，尤其以蒽的促進作用最為明顯，達725.18±30.71 U/L。據(jù)此，選取蒽作為產酶培養(yǎng)基最優(yōu)誘導物。

綜上，PC菌漆酶產量受產酶培養(yǎng)基培養(yǎng)條件影響較大，產漆酶培養(yǎng)條件參數(shù)可優(yōu)化為：碳源為羧甲基纖維素鈉20.00 g/L、氮源為硝酸鈉5.00 g/L、磷源為磷酸氫二鉀2.00 g/L、Cu2+濃度為1.00 μmol/L、誘導劑為蔥2.00×10-4mmol/L。

圖2 培養(yǎng)基條件對漆酶分泌的影響

3.3 培養(yǎng)環(huán)境對漆酶分泌的影響

在最佳產酶培養(yǎng)基條件下，本研究選取初始pH值(3、4、5、6、7、8、9)、培養(yǎng)溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)、搖床轉速(0、50、100、150、200、250、300 r/min)及接種量(體積分數(shù)，0.20%、0.50%、1.00%、2.00%、2.50%、3.00%)4個指標綜合考察培養(yǎng)環(huán)境對漆酶分泌效果的影響。

如圖3(a)所示，漆酶活性在初始pH值5～7均活性最強，最高可達700.13±22.14 U/L。當pH<5時，漆酶活性迅速下降至10.33±0.55 U/L；pH>7時，漆酶活性呈緩慢下降趨勢，表明PC菌在酸偏中性環(huán)境中可以保持較好的活性。據(jù)此，選擇pH值5～7為最優(yōu)初始pH值。

如圖3(b)所示，漆酶活性在30 ℃時活性最強，達213.14±15.13 U/L。當培養(yǎng)溫度>30 ℃時，漆酶產量明顯降低，最低僅為6.02±2.33 U/L。據(jù)此，從大規(guī)模工業(yè)化生產和產酶效率的角度綜合考慮，30 ℃是較為適宜PC菌生產漆酶的培養(yǎng)溫度。

如圖3(c)所示，隨轉速的增加，漆酶活性呈逐漸上升趨勢，當轉速達到200 r/min 時，PC菌產漆酶活性最高，達523.17±30.99 U/L；當轉速>200 r/min，漆酶活性呈現(xiàn)下降趨勢，這主要是由于振動產生的機械剪切力破壞酶結構所致。據(jù)此，選擇200 r/min作為最優(yōu)搖床轉速。

如圖3(d)所示，隨著菌體接種量的增加漆酶活性呈上升趨勢，當菌體接種量為1.5%時，酶活性達到最大值，為415±33.28 U/L。當接種量>1.5%，漆酶活性穩(wěn)定在300 U/L左右。據(jù)此，選擇1.5%為最優(yōu)接種量。

綜上，環(huán)境條件的變化亦對漆酶活性產生較大影響，PC菌產漆酶最優(yōu)環(huán)境參數(shù)可優(yōu)化為初始pH值為5～7、初始溫度30 ℃、搖床轉速為200 r/min，接種量1.5%。

圖3 培養(yǎng)環(huán)境對漆酶活性的影響

3.4 粗酶制劑性能評價

高效石油降解制劑原油降解效率隨時間變化曲線如圖4所示。由圖4可知，經(jīng)過18 d的原油降解實驗，復合制劑(粗酶制劑+菌液)對原油TPHs降解效果顯著高于單一制劑(僅投加菌液)，TPHs去除率分別為63.13%和46.75%。

圖4 原油降解效率隨時間變化曲線

從原油速率來看，單一制劑對原油的降解存在4 d遲滯期，而復合制劑對原油的降解僅存在2 d的遲滯期。利用SPSS軟件計算可知，單一制劑的反應速率模型為：C=92.02e-0.019t，復合制劑的反應速率模型：C=86.74e-0.022t，故復合制劑的原油降解速率約為0.022[mg/(L·d)]，單一制劑的原油降解速率約為0.019[mg/(L·d)]，表明粗酶制劑可有效加快微生物對石油降解的啟動速度。

綜上，粗酶制劑不僅能加快微生物降解原油的啟動速度，還可加強菌種的底物利用范圍，對石油污染修復起著至關重要的作用。

4 結論

本研究采用單因素實驗分別考察產酶培養(yǎng)基條件及培養(yǎng)環(huán)境條件對PC菌產漆酶活性的影響，得出了漆酶最佳液體發(fā)酵工藝參數(shù)：初始pH值5～7、初始溫度30 ℃、搖床轉速200 r/min，接種量1.5%、碳源為羧甲基纖維素鈉20.00 g/L、氮源為硝酸鈉5.00 g/L、磷源為磷酸氫二鉀2.00 g/L、Cu2+濃度為1.00 mmol/L、誘導劑為蔥2.00×10-4mmol/L。同時，基于最佳漆酶發(fā)酵工藝參數(shù)開展粗酶制劑原油生物降解性能評價。結果表明：復合制劑原油TPHs降解效率顯著單一制劑，可有效提高微生物原油降解速率，具備更為強大的環(huán)境耐受性和微生物底物作用能力。