蝦青素乳油的研究與開發(fā)
——基于酵母菌的深層發(fā)酵

譚麗娟，朱文婷，陳洪彪，代萬富，黃紹鴻，于 敏

(武漢工商學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065)

1 引言

蝦青素屬于一種萜烯類不飽和化合物，為一種廣泛存在于生物界的酮式類胡蘿卜素[1]。蝦青素因具有很強(qiáng)的生物活性而具有廣闊的應(yīng)用市場，其作用包括具有抗疲勞抗氧化的作用[2]；其抗氧化與抗炎作用可保護(hù)神經(jīng)元[3]；在抗腫瘤方面也有一定的作用，其機(jī)理可能與抑制PPARγ表達(dá)有關(guān)[4]；在增強(qiáng)免疫力及視力方面有一定的效果[5]；具有著色功能，是很好的天然紅色素等。目前蝦青素主要來源的菌種是雨生紅球藻和紅法夫酵母[6]，而所產(chǎn)生的蝦青素產(chǎn)量比較低，本項(xiàng)目就利用酵母制備蝦青素乳油，旨在提高乳油中蝦青素含量，所以本課題具有一定的研究意義和價(jià)值，可為相關(guān)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)路線。

2 材料、試劑及培養(yǎng)基

菌株：酵母菌，由武漢工商學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心環(huán)境與生物工程分中心保存。

主要試劑：DMSO(AR)、正己烷(AR)、丙酮、NaOH(AR)、二氯甲烷(AR)、石油醚(AR)、葡萄糖(BR)、酵母浸膏(BR)、蔗糖(AR)、牛肉膏(BR)，均來自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣，Sigma公司；番茄紅素，江蘇采薇生物科技有限公司。

主要儀器：SPX-100B-D型振蕩培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、752型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52CS(上海亞榮生化儀器廠)。

培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L；蔗糖10 g/L；酵母膏10 g/L；牛肉膏2.5 g/L；瓊脂粉20 g/L。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法

用100 mg/L蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液和DMSO-丙酮混合液配制2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L等一系列濃度的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長為478 nm的條件下分別測定其吸光度，以蝦青素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 菌種活化與培養(yǎng)

用接種環(huán)挑取酵母菌于液體培養(yǎng)基中活化，活化后的菌種接于種子培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度22 ℃，時(shí)間18 h，轉(zhuǎn)速150 r/min。

將種子液按1∶10接入培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中搖瓶培養(yǎng)，約25 h后取出培養(yǎng)瓶并向其中加入濃度分別為0 μg/g、20 μg/g、40 μg/g、60 μg/g、80 μg/g的番茄紅素，以引入蝦青素合成前體物質(zhì)[7]，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)15 h，培養(yǎng)條件：溫度22 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

3.3 蝦青素的提取

3.3.1 不同破壁方法提取蝦青素

分別利用機(jī)械法、化學(xué)法、自溶法對菌體進(jìn)行破壁處理。機(jī)械法采用研磨法用丙酮作為助磨劑處理菌體；化學(xué)法采用DMSO溶液70 ℃條件下處理菌體；自溶法利用NaCl溶液作為質(zhì)壁分離劑，在pH值為7、溫度為55 ℃條件下自溶3 h，處理后離心。

3.3.2 不同破壁時(shí)間提取蝦青素

取一定量離心所得的菌體，加入DMSO-丙酮混合液，在40 ℃的條件下分別破壁處理20 min、40 min、60 min、80 min、100 min。在478 nm波長下測定樣品液的吸光度。

3.4 蝦青素提取液的萃取與濃縮

將蝦青素粗品于分液漏斗，加入約其1/2體積的石油醚，邊加邊振蕩，靜置分層后加入石油醚等體積的無水乙醇及適量蒸餾水，去除乙醇相，將石油醚相進(jìn)行蒸發(fā)濃縮(條件：真空度0.08 MPa，溫度30 ℃)，產(chǎn)品于烘箱避光干燥。

3.5 蝦青素的皂化

分別配制濃度為20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L的NaOH溶液并與乙醇混合制成質(zhì)量濃度為40.3 kg/m3的混合液；取濃縮干燥所得樣品按1∶5溶于二氯甲烷溶液中，充分溶解后，按1∶5加入乙醇-NaOH混合液，置磁力攪拌器上進(jìn)行皂化，20 min后加入適量蒸餾水直到反應(yīng)混合液迅速出現(xiàn)分相時(shí)停止皂化反應(yīng)，收集下層有色相得皂化產(chǎn)品，于冰箱中冷藏，待二氯甲烷相完全澄清，分液，進(jìn)行真空濃縮。

分別取少量干燥后的產(chǎn)品溶于DMSO-丙酮混合液，在478 nm波長下測定吸光度。

3.6 制備蝦青素乳油的方法

在以上考察因素最佳條件下進(jìn)行發(fā)酵與提取，真空干燥得蝦青素，向所得蝦青素中按1∶10的比例加入大豆油，使蝦青素充分溶于大豆油中，加入乙醇溶液，充分反后轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，將未反應(yīng)的乙醇溶液蒸出，既得蝦青素乳油。

4 結(jié)果與分析

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0855x+0.0154，R2為0.9987，表明蝦青素質(zhì)量濃度在0～12 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.2 前體物質(zhì)對蝦青素產(chǎn)量的影響

向各組發(fā)酵液所得菌體中加入DMSO-丙酮混合液處理20 min，測定各組樣品液吸光度，得前體物質(zhì)加入量與蝦青素濃度關(guān)系如表1所示。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，向培養(yǎng)基中引入蝦青素合成前體物質(zhì)可顯著增加蝦青素合成率，并非前體物質(zhì)加入量越多越好，在番茄紅素加入量為60 μg/mL時(shí)，樣品中蝦青素含量最高，濃度為5.32 μg/mL，但當(dāng)番茄紅素加入量為80 μg/mL時(shí)，反而不利于蝦青素的合成。

4.3 不同破壁方法對蝦青素提取的影響

運(yùn)用不同的破壁方法處理菌體，測定其中蝦青素含量，得蝦青素濃度與破壁方式的關(guān)系如表2所示；表明利用化學(xué)方法對菌體細(xì)胞進(jìn)行破壁處理所得蝦青素含量相較于研磨法和自溶法高，可達(dá)到2.29 μg/mL，故在蝦青素的提取過程中宜采用化學(xué)方法對菌體細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，以提高蝦青素的提取率。

表1 前體物質(zhì)對蝦青素合成的影響

表2 不同破壁方法對蝦青素提取的影響

4.4 不同破壁時(shí)間對蝦青素提取的影響結(jié)果

利用DMSO-丙酮混合液對菌體壁以不同時(shí)間處理后測定蝦青素含量，得吸光度最大值為0.531，從圖2知，在破壁處理過程中，處理60 min為宜；處理時(shí)間在20～60 min的時(shí)間范圍內(nèi)，處理時(shí)間越長，樣品液中的蝦青素含量越高，但處理時(shí)間超過60 min以后，樣品液中蝦青素的含量卻有所下降。故破壁處理時(shí)，處理的時(shí)間不宜過長。

圖2 不同處理時(shí)間對蝦青素提取含量的影響

4.5 不同濃度的堿對皂化效果的影響

利用不同濃度的NaOH溶液對提取液進(jìn)行皂化處理后于478 nm的波長下測定吸光度，得樣品液中蝦青素含量與堿濃度的關(guān)系如圖3所示，隨著堿濃度的升高，樣品皂化效果越好，當(dāng)堿濃度為20 g/L時(shí)，蝦青素的皂化效果達(dá)到最好，其濃度為5.27 μg/mL，當(dāng)堿濃度超過20 g/L時(shí)，蝦青素的濃度呈下降趨勢。

圖3 堿濃度對蝦青素皂化影響

4.6 蝦青素乳油的制備

圖4為試驗(yàn)各項(xiàng)考察因素最優(yōu)條件下得到的蝦青素乳油產(chǎn)品，顏色呈現(xiàn)為橘紅色，為不透明乳狀物。

圖4 蝦青素乳油

5 結(jié)論

通過對培養(yǎng)條件、提取方法的優(yōu)化，可明顯提高蝦青素提取率；培養(yǎng)條件優(yōu)化后得其濃度為5.32 μg/mL，相比優(yōu)化前增加了2.85 μg/mL；化學(xué)方法對菌體進(jìn)行破壁處理，得濃度為2.29 μg/mL，較機(jī)械法和自溶法的提取量分別增加0.69 μg/mL、1.17 μg/mL；通過對比破壁時(shí)間對蝦青素提取效果，優(yōu)化后得濃度為5.96μg/mL，相比優(yōu)化前增加了2.02 μg/mL；通過皂化過程不同濃度NaOH溶液對蝦青素提取效果的考察，優(yōu)化后濃度為5.27 μg/mL，較優(yōu)化前濃度提高了4.15 μg/mL；綜上得前體物質(zhì)、NaOH溶液濃度兩個(gè)因素對蝦青素的提取影響最大。通過對培養(yǎng)條件和提取方法的研究，使獲得的蝦青素濃度較近年的報(bào)道有較大提升，試驗(yàn)中隨蝦青素產(chǎn)率的提升，相應(yīng)的蝦青素在乳油中濃度也會提升，不僅降低了成本，也可為蝦青素提取率的提高及其產(chǎn)品的制備提供技術(shù)路線，為其工業(yè)化發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。