農(nóng)藥多菌靈對黑藻和金魚藻的葉綠素、蛋白質(zhì)、還原糖含量影響對比及分析

毛一博，陳天睿，裴 璐，李浩正

(蘭州市第五十八中學，甘肅 蘭州 730060)

1 引言

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展依靠大量化肥與農(nóng)藥的施用，然而近年來農(nóng)藥的施用量有增無減，實際利用率卻十分低下，且許多農(nóng)藥結構穩(wěn)定，難以降解，這對湖泊、河流以及地下水等水體都造成了污染。農(nóng)藥進入生態(tài)環(huán)境造成水污染大體上可通過以下3種方式：一是未被利用的農(nóng)藥隨雨水進入水體；二是降水、灌溉等造成的水土流失使部分尚未被利用的農(nóng)藥流入河流；三是農(nóng)藥廠或?qū)嶒炇覍⑽唇?jīng)處理的農(nóng)藥直接排入河流[1,2]。

藻類具有個體小、易獲得、繁殖快、對水體中的有毒物質(zhì)十分敏感的特點，是農(nóng)藥污染的理想指示物種。藻類可用于反映水體的污染狀況，一些抗逆性較好的藻類還可用于凈化水體，結果更具有現(xiàn)實意義。在此背景下，本實驗試圖通過比較黑藻和金魚藻對農(nóng)藥多菌靈的抗逆性以及其對于多菌靈污染水體的凈化作用，初步探尋適宜大量種植的水體凈化藻類，提高“保護生態(tài)資源就是造福人類”的環(huán)保意識。

2 實驗部分

2.1 葉綠素的測定

2.1.1 儀器與試劑

所用儀器為UV-3200型紫外可見分光光度計(上海美譜達責任有限公司)、研缽、比色皿(2 mL)、比色管(25 mL)、水浴鍋、燒杯(250 mL)、膠頭滴管、分析天平；所用試劑為90%乙醇、1 mol/L HCl。

2.1.2 實驗方法

使用乙醇提取葉綠素，在紫外分光光度計下分別測定未加鹽酸和加鹽酸的吸光度，依據(jù)公式得到含量。

2.1.3 實驗步驟

用分析天平準確稱量0.500 g藻類樣品，放入研缽加5 mL 90%乙醇研成勻漿，全部移入25 mL比色管，用90% 乙醇定容至刻度線。置于75 ℃水浴鍋中提取5 min。提取樣液進行測定。采取紫外分光光度計讀取其665 nm和750 nm處的吸光度數(shù)值，90%乙醇溶液為參比。之后再加入2滴1 mol/L HCl，重新測量一次。依據(jù)公式計算得到葉綠素含量[3]。

葉綠素含量=27.3(EA-Eb)

(1)

Ea為提取液酸化前波長665 nm和750 nm處吸光度之差；

Eb為提取液酸化后波長665 nm和750 nm處吸光度之差；

2.2 蛋白質(zhì)的測定

2.2.1 儀器與試劑

所用儀器為UV-3200型紫外可見分光光度計(上海美譜達責任有限公司)、研缽、比色皿(2 mL)、試管、水浴鍋、燒杯(250 mL)、膠頭滴管、分析天平、離心機、離心管、移液管；所用試劑為pH值=7.0的磷酸緩沖溶液。

2.2.2 實驗方法

提取蛋白質(zhì)溶液，在紫外分光光度計中在260 nm、280 nm波長下分別測量吸光度，依據(jù)公式得到含量。蛋白質(zhì)分子中色氨酸、賴氨酸的殘基在280 nm下有最大吸收。核酸在260 nm處也有吸收，可以通過校正加以消除[4]。

2.2.3 實驗步驟

使用分析天平精確稱量0.500 g藻類樣品，放入研缽中，加入pH值=7.0的磷酸緩沖溶液，研成勻漿，移入離心管2000 r/min離心10 min。用移液管取1.00 mL樣液至試管當中，加入5 mL pH值=7.0的磷酸緩沖溶液，在紫外分光光度計中分別在280 nm和260 nm波長下讀取吸光度，以pH值=7.0的磷酸緩沖溶液作參比[5]。依據(jù)公式計算得到蛋白質(zhì)含量。

(2)

式(2)中，n為稀釋倍數(shù)，本實驗中n=6。

2.3 還原糖的測定

2.3.1 儀器與試劑

所用儀器為UV-3200型紫外可見分光光度計(上海美譜達責任有限公司)、研缽、比色皿(2 mL)、試管、水浴鍋、燒杯(250 mL)、膠頭滴管、分析天平、移液管、離心機、離心管；所用試劑為斐林試劑、蒸餾水。

2.3.2 實驗方法

植物組織中的還原糖含有醛基或羰基，可以還原斐林試劑使其脫色，脫色程度與含糖量成正比，在紫外分光光度計中590nm波長下測定吸光度，對比標準曲線得到含糖量[6]。

2.3.3 實驗步驟

用分析天平精確稱量1.000 g藻類樣品，在研缽中加蒸餾水研成勻漿，移入試管中。將試管置于80 ℃的恒溫水浴中保溫30 min，期間每5 min搖動一次，使還原糖充分提取出來[7]。用移液管量取6.00 mL待測液至試管中，加入4 mL斐林試劑，封口后于沸水浴中加熱15 min，取出后用自來水冷卻，移入離心管，1500 r/min離心15 min。取上清液，用分光光度計在590 nm波長下測定吸光度，以蒸餾水作參比。與標準曲線對照得出還原糖含量[8]。

還原糖含量=

(3)

2.4 COD(化學需氧量)的測定

2.4.1 儀器與試劑

所用儀器為COD快速測定儀(北京連華永興科技發(fā)展有限公司)、比色皿、消解管、移液管、玻璃棒、冷卻槽；所用試劑為D液(重鉻酸鉀溶液)、E液。

2.4.2 實驗方法

在強酸性條件下通過重鉻酸鉀的氧化性氧化水中的諸多有機物，由機器前后比對得到COD數(shù)值，代表了水受有機物污染的程度。

2.4.3 實驗步驟

使用玻璃棒攪動水體，然后立即用移液管量取水樣2.5 mL在消解管中，用移液管加入D液0.7 mL，E液4.5 mL。充分振蕩后，放入測量儀中充分解離，拿出后用自來水冷卻，轉(zhuǎn)移到比色皿中進行測量，記錄數(shù)據(jù)。

2.5 色度、濁度的測定

2.5.1 儀器與試劑

所用儀器為UV-3200型紫外可見分光光度計(上海美譜達責任有限公司)、比色皿(2 mL)、膠頭滴管、燒杯、玻璃棒。

2.5.2 實驗方法

色度和濁度直觀反映了水體清澈程度，度數(shù)越高，水體質(zhì)量越差。直接量取培養(yǎng)藻類的水，在紫外分光光度計中320 nm波長下測得色度，580 nm波長下測得濁度。對比標準曲線得到度數(shù)。

2.5.3 實驗步驟

使用玻璃棒攪動水體，以保證色度、濁度測量結果準確，然后立即用膠頭滴管量取水樣在比色皿中，放入紫外分光光度計中測量吸光度。對比標準曲線得出度數(shù)。

圖1是濁度標準曲線，將實驗中測得的吸光度帶入濁度標準曲線計算出濁度，單位為度。

圖1 濁度標準曲線

圖2是色度標準曲線，將實驗中測得的吸光度帶入色度標準曲線計算出色度，單位為度。

圖2 色度標準曲線

3 結果與討論

圖3、表1為兩種藻類的還原糖含量對比，黑藻與金魚藻在總趨勢上都是下降的，但是在一開始，黑藻卻呈現(xiàn)上升趨勢，并在第二個周期后達到最高點，之后呈波浪式下降，且有趨于平穩(wěn)的趨勢。金魚藻在一開始就有下降，能夠?qū)τ诙嗑`做出快速反應，之后也是呈波浪式下降，但變化幅度較大，不穩(wěn)定。

因為植物中的還原糖含量與植物的新陳代謝密切相關，對此推測多菌靈會導致金魚藻的代謝異常，從而影響其正常生長，而我們觀察到金魚藻的生長狀況較黑藻明顯不佳也與此推測吻合，同時兩種藻類在后期都出現(xiàn)穩(wěn)定趨勢，我們推測這與植物自身的反饋調(diào)節(jié)有關。

表1 兩種藻類還原糖含量變化

圖4、表2為兩種藻類的葉綠素含量，在一開始兩種藻類的葉綠素含量都有所上升，這說明兩種藻類的光合作用強度在上升，初步推測在第一個周內(nèi)，藻類在水體尚能正常生長，這或許是由于葉綠體的膜結構或是細胞中存在其他結構可以延緩外界不利環(huán)境對于葉綠體的損傷；但一周之后，兩種藻類的葉綠素含量都呈現(xiàn)大幅下降的趨勢，總體圖像呈現(xiàn)倒“V”型，這證明農(nóng)藥對于葉綠體的傷害較大且相關保護結構的作用存在極限。

圖3 兩種藻類的還原糖含量對比

表2 兩種藻類葉綠素含量變化

圖4 兩種藻類的葉綠素含量

圖5、表3為兩種藻類蛋白質(zhì)的含量變化圖，兩種藻類在這一指標上同步變化，在開始的兩個周期里，藻類的蛋白質(zhì)含量都呈現(xiàn)下降趨勢，但后期金魚藻的蛋白質(zhì)含量回升更快，在實驗的4個周期里金魚藻蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)上升態(tài)勢，黑藻則在下降后趨于平穩(wěn)。

在第四周期觀察到金魚藻出現(xiàn)腐爛，水中有菌落生長，結合數(shù)據(jù)我們推測，因為金魚藻中蛋白質(zhì)含量較高，既可以為水中微生物提供優(yōu)良的營養(yǎng)，又因為蛋白質(zhì)的空間結構易被破環(huán)，因此金魚藻在農(nóng)藥溶液中易腐敗，在不利環(huán)境中的生存能力不及黑藻。

圖6、表4與圖7、表5分別表示濁度與色度。從濁度比較來看，兩種藻類對于水體都有著明顯的凈化作用，說明養(yǎng)殖水藻能夠有效吸附水中的懸浮物，降低濁度。但從色度來看，金魚藻后期有逐漸上升的趨勢，黑藻則能夠降低色度，由于金魚藻葉片細碎，在后期水體顏色加深明顯，有一組甚至發(fā)霉，導致色度攀升。

表3 兩種藻類蛋白質(zhì)含量變化

圖5 兩種藻類蛋白質(zhì)含量

表4 兩種藻類水體濁度變化

表5 兩種藻類水體色度變化

圖6 兩種藻類濁度變化

圖8、表6表示兩種藻類COD(化學需氧量)的變化圖，黑藻總體呈現(xiàn)下降趨勢，金魚藻則呈上升趨勢，說明金魚藻對于水體的凈化能力不如黑藻，水中有機物污染加劇，在培養(yǎng)過程中我們也直觀地看到了這種表現(xiàn)：在金魚藻的4個平行樣中，有一個在最后一個周期里長出了黑色霉斑，這是水體腐敗到一定程度的表現(xiàn)。黑藻則能夠降解吸收一部分水中的污染物，而且直觀看來，水體中并沒有金魚藻那么多殘渣。

圖7 兩種藻類色度變化

表6 兩種藻類水體COD變化

圖8 兩種藻類COD的變化

4 總結與討論

本文初步利用紫外分光光度法探究了在相同濃度的多菌靈溶液(有效成分濃度0.5 mg/L)中黑藻和金魚藻在研究周期(4周)里的葉綠素、蛋白質(zhì)、還原糖三項指標的變化，并通過比較這些生物指標來反映藻類對于農(nóng)藥的反應。在水體方面，通過色度、濁度、COD(化學需氧量)3個指標反映出了藻類對于水體的影響。初步得出以下結論。

(1)利用紫外分光光度法能夠快速、準確地得到藻類生物指標的具體數(shù)值，這一方法可以廣泛的應用于各種植物的各項生物指標的準確檢測。

(2)黑藻對于多菌靈溶液的抗逆性更好，在本實驗的3個指標中，黑藻表現(xiàn)更好，指標更加穩(wěn)定，部分指標在最后還有上升的趨勢。金魚藻則呈現(xiàn)出下降趨勢，并且可以明顯觀察到葉片的腐爛、變黃，這說明金魚藻更易腐爛。

(3)黑藻對于水體凈化效果更好，在濁度和色度兩個指標上黑藻更低一些，而金魚藻則導致水體渾濁。在COD指標上，黑藻有明顯的優(yōu)勢，這說明水體中的有機農(nóng)藥能夠被黑藻吸收。

(4)同時，實驗表明在池塘、魚缸等地方養(yǎng)殖金魚藻并不是一個十分明智的選擇，適當種植黑藻或許更加有利于水體凈化，可以延長抽換水的周期。

綜上所述，多菌靈作為廣譜殺菌劑對于黑藻和金魚藻確實有影響，金魚藻由于其較高蛋白質(zhì)含量，對于農(nóng)藥更加敏感，各項指標變化更加明顯、波動更大，致使水體明顯渾濁；黑藻則對多菌靈表現(xiàn)出良好的抗逆性，其生理指標較穩(wěn)定，且對于水體的凈化效果明顯。

本實驗運用化學方法來分析生物生長狀況，結論更為客觀、直觀，實驗過程快捷，且適用面廣泛。但由于實驗時間、個人能力的不足對多菌靈對于黑藻和金魚藻的影響探究不足，討論后認為應當在以后進行后續(xù)實驗圍繞以下幾點探究。

(1)設置濃度梯度來研究各種濃度的農(nóng)藥對于兩種水藻的影響，尋找水藻降解農(nóng)藥的最有效率濃度。

(2)增加藻類種類，尋找一種最為經(jīng)濟、高效的降解多菌靈的藻類，這樣可以使得這個實驗的實際應用更加可能。

(3)為落實多菌靈對于藻類影響是直接影響還是通過影響水體間接影響藻類設計進一步實驗。