碳化硅量子點熒光標記技術及其生物學應用

康 杰，孫為云，丁紫陽，周 喜，雷騰飛，宋月鵬

(1.鄭州職業技術學院材料工程系，鄭州 450121;2.齊魯理工學院機電工程學院，濟南 250200;3.山東農業大學機械與電子工程學院，泰安 271000)

1 引 言

半導體量子點作為一種新型的熒光標記物，在生命科學、生物醫學等領域具有及其重要的應用。半導體量子點與傳統的有機染料或熒光蛋白相比，具有發射光譜窄、化學及光學穩定性好、發射光色可調、激發范圍寬及其表面特異性蛋白耦聯水平成熟，為動態顯像、實時目標跟蹤、原位，DNA檢測，生物芯片及傳感器等研究提供了新的發展契機[1-2]。

目前，量子點標記技術在人工晶體、生命科學及農業工程技術領域中也是較為前沿的研究方向[3]，量子點標記技術作為一種新型標記技術，在許多領域的應用越來越受到關注。雖然近幾年對鎘系量子點作為標記材料的標記技術研究較為成熟，但是，CdSe、CdTe、CdS等鎘系量子點的細胞毒性與其結構尺寸的難以控制在一定程度上阻礙了其在量子點標記技術及其應用上的進一步發展[4]。近段時間以來，由半導體碳化硅制備出的量子點熒光標記物，因為它的生物相容性、親水性良好且腐蝕法制備工藝簡便而日漸為研究者們熟知[5-6]。

基于此，本文利用一步法制備出新型標記材料碳化硅量子點，利用其水相溶液對有、無根皮苷環境下的串珠鐮刀菌進行標記，對該菌長期培養，并對活細胞進行長期熒光成像，以動態監測串珠鐮刀菌長期處于根皮苷環境下的生長、分裂機制、深入探索其生長環境中根皮苷含量的多少與其生長態勢的相干性，初步探討了該菌對連作園中蘋果幼苗的感染機理。

2 實 驗

2.1 熒光標記材料SiC量子點的制備

將40%的氫氟酸、65%的濃硝酸以及分析純硫酸按照V(HF)∶V(HNO3)∶V(H2SO4)=6∶1∶1的體積比配制成腐蝕液。將自蔓延燃燒合成的均質β-SiC粉末經球磨機振動球磨(約6 h)后倒入上述腐蝕液并在室溫條件下加以攪拌1 h。靜置半小時后抽取上清液并將余下腐蝕液放置在電熱鼓風干燥箱中烘干，對其機械研磨后加入適量超純水配制成溶液，而后放置于超聲分散儀做超聲處理25 min，將超聲空化、粉碎分散后的SiC顆粒懸浮液放置在高速臺式離心機中進行一定時間的高速離心層析剪裁，顆粒尺寸相對較大的便由于離心力作用而沉于底部，則上層清液即為小尺寸的碳化硅量子點水相溶液。

2.2 活體細胞試驗

在本文中，所使用的串珠鐮刀菌是從連作蘋果園的腐爛的蘋果根中分離提純出來的。詳細培養過程是：

首先，刮取兩環冷藏在霉菌恒溫箱里的斜面菌種，無菌情況下接種至PD培養基內活化；然后，無菌情況下用量筒分別量菌液(串珠鐮刀菌的PD培養基)90 mL、SiC水相溶液30 mL，混合配制成如表1所示四種不同的菌液試樣，其中V(菌液)∶V(SiC量子點水相溶液)=3∶1。

表1 串珠鐮刀菌菌液處理Table 1 The treatment of fusarium moniliforme sheld lysate

菌液1作為對照組試樣，菌液2、菌液3、菌液4則分別為加入碳化硅量子點但不同根皮苷含量的生長環境；然后將四組菌液試樣放置在振蕩器(恒溫28 ℃)中培養一個月，培養期間每天分別從四種菌液試樣中抽樣、觀察(熒光顯微鏡下)、照相及記錄觀察到不同時期菌落的分裂和成長情況。

2.3 儀器表征

利用日本JEOL公司生產的H-9500型透射電子顯微鏡檢測碳化硅量子點(粉末)微觀結構、微觀形貌；利用日本日立公司生產的F-7100型熒光分光光度計測試碳化硅量子點(水相溶液)的激發和發射光譜；利用美國珀金埃爾默公司生產的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀分析碳化硅量子點表面親有機物基團(巰基)的伸縮指紋區；利用德國萊卡公司生產的DMi8-M型倒置熒光顯微鏡觀察經碳化硅量子點標記后串珠鐮刀菌活體細胞的生長狀況及其侵染蘋果幼苗根部過程的動態示蹤。

3 結果與討論

3.1 SiC量子點的發光機理

當顆粒尺寸達到納米量級的時候，尺寸限制將引起一系列與體相材料不同的性質，如尺寸效應、量子限域效應等，與常規體系和微觀體系不同的是，量子點具有許多獨特的低維物性，呈現出許多特殊的光學性質；正是由于量子點自身的這些量子效應，才使得量子點具有特殊的光學性能。半導體分為直接帶隙半導體和間接帶隙半導體兩種，而SiC量子點屬于后者，因此尺寸效應的影響在其上表現的尤為明顯；當量子點受到外界光刺激時，其體材低能級價帶上的電子因吸收外界光子增加能量而向高能級的導帶躍遷，根據玻爾茲曼分布特性高能級電子極其活躍并且具有向低能級價帶躍遷的幾率非常大，這種由導帶再次躍遷回價帶而發射光子的現象即為碳化硅量子點的光致發光。

對共性問題進行綜合分析，打出“組合拳”。系統根據預設的評價規則，對全市指標評價結果進行多層面多維度綜合分析，找出共性問題。例如，對干部廉政守正問題進行分析時，發現全市多家單位在辦理群眾投訴舉報時有不及時、不到位現象，不同程度存在干部不作為、慢作為問題。為此，我們依托“民聲通”、政風熱線等平臺，針對部門行業存在的突出問題開展專項治理，倒逼黨員干部勇于擔當、履職為民，切實改進廣大黨員干部的工作作風。

圖1 不同光照條件下水相碳化硅量子點的顏色 (a)白光激發;(b)320 nm單色光激發;(c)340 nm單色光激發Fig.1 Color of water-phase silicon carbide quantumdots under different illumination conditions(a)excitation under white light;(b)excitation under 320 nm monochromatic light;(c)excitation under 340 nm monochromatic light

3.2 SiC量子點的微觀形貌及其光學特性

腐蝕法制備出的碳化硅量子點水相溶液在自然光下呈現RGB值為R:255 G:234 B:180的顏色[9-10]如圖1a所示；在暗室中用手提式紫外分析儀對其進行照射，當該分析儀的激發光波長設定為波長為320 nm時，碳化硅量子點水相溶液呈現RGB值為R:196 G:215 B:0的熒光如圖1b所示，而當把激發光波長調至340 nm檔位時，溶液又呈現RGB值為R:41 G:131 B:177的熒光情況，如圖1c所示。碳化硅量子點水相溶液光致發光顏色隨外界光照條件(激發光波長)的變化而不同，具體表現為隨激發光波長的增加使得量子點光致發光的顏色出現了紅移。該結果與宋月鵬等課題組的研究結果相吻合[11-12]。碳化硅的這一多色熒光特性為同時標記同一客體不同部位的組織、同一組織的多個細胞等提供了理論依據。

通過F-7100型熒光分光光度計進一步表征水相SiC量子點的熒光發射光譜，選取五個波長不同、波長間隔相同的激發光，其波長分別為320 nm、340 nm、360 nm、380 nm、420 nm的激發光對一步法制備的碳化硅量子點水箱溶液試樣進行激發測試，其室溫下光致發光特征發射光譜如圖2(a)所示。

圖2 (a)SiC QDs不同波長激發光下的發射譜圖;(b)SiC QDs水相溶液的TEM照片Fig.2 (a)Emission spectra of SiC QDs under different wave;(b)TEM image of aqueous SiC QDs

當激發光波長由320 nm經340 nm、360 nm、380 nm以相同波長間隔地穩步增加到420 nm，碳化硅量子點熒光強度最大值對應的發射波長則由415 nm紅移到450 nm的發射波長，此結果驗證了碳化硅量子點的量子限制效應；同時也表明小尺寸碳化硅量子點的光致發光現象。將制備出的碳化硅量子點水相溶液滴到銅網上，而后把它置于高清透射電鏡下觀察，結果如圖2b所示。從圖中可以看出，碳化硅量子點納米顆粒近似呈球形，而且其尺寸分布也十分均勻，直徑幾乎均在2 nm左右，而SiC體材料激子波爾(Bohr)直徑為5.4 nm，根據顆粒尺寸接近或小于體材激子波爾直徑便會產生光致發光的原理，在外界光束(波長合適)的激發下該量子點水相溶液可形成極為顯著的光致發光現象。

圖3 碳化硅量子點的傅里葉變換紅外(FTIR)光譜圖Fig.3 FTIR spectrum of SiC QDs

在對碳化硅量子點的腐蝕法制備工藝研究初期，李永、范吉陽、孫祥鳴等[5-6,9]都制備出了表面具有羧基、羥基親有機物基團的碳化硅量子點，這在一定程度上提高了其親水性、生物相容性；然而，本課題組通過向腐蝕劑中添加適量的耦合劑(分析純硫酸)，便一步法制備出了表面具有除羧基、羥基外而且還含有巰基(-SH)的碳化硅量子點，圖3是碳化硅量子點的傅里葉變換紅外線(FTIR)光譜，通過紅外光譜圖的指紋區可以非常明顯的看出，吸收峰為614 cm-1的位置檢測到強烈的伸縮振動，而這正是親有機物基團-SH的伸縮振動指紋區。

巰基的存在不僅使得與其一端連接的碳化硅量子點具有非常強的親水性，而且更重要的是，巰基的另一端非常容易與特定物質(例如特定蛋白質)結合，由此可知，巰基在碳化硅量子點表面的成功耦合，為以后醫學、生物學特異性標記技術的實現及臨床應用提供了理論依據和技術支撐。

3.3 串珠鐮刀菌的標記與成像

對未添加量子點標記材料的菌液試樣(菌液1)、添加量子點標記材料的菌液試樣(菌液2)在相同的無菌、恒溫條件下培養3 d，滴到載玻片并將其置于DMi8-M型倒置熒光顯微鏡下進行觀察，調節顯微鏡上的激發光波長檔位，把檔位撥至藍光(約340 nm)時對當前視野拍攝照片，其結果如圖4所示。

從拍攝結果可以看到，菌液1(無量子點標記材料)在熒光顯微鏡下視野中不能看到任何菌落及其生長狀況如圖4a，而菌液2(含量子點標記材料)在熒光顯微鏡下透出明亮的熒光如圖4b。將產生明亮熒光的菌液2試樣置于波長為340 nm的激發光下持續1 h,結果發現顯微鏡視野中菌液2的熒光強度沒有絲毫減弱，這表明作為間接帶隙半導體的碳化硅量子點，雖然發光效率較低，但相比于有機熒光染料具有極強的抗漂白能力，其光學性能表現極其穩定。這為實現活體細胞及其亞結構的標記奠定了光學基礎。

圖4 (a)無SiC QDs的菌液1(340 nm的藍光激發);(b)有SiC量子點的菌液2(340 nm的藍光激發)Fig.4 (a)Without SiC QDs(excited wavelength 340 nm);(b)with SiC QDs(excited wavelength 340 nm)

圖5 經SiC標記的鐮刀菌的長時程成像(a)15 d;(b)30 dFig.5 Long-term imaging for fusarium moniliformewhich labeled by SiC QDs (a)15 d;(b)30 d

考察根皮苷對串珠鐮刀菌分裂機制、生長的影響必須確保熒光標記材料滿足對該菌標記的長時程性，前期研究中，孫祥鳴等[9]利用SiC量子點對出牙短梗霉菌的熒光成像實驗中提到了長時程性，宋月鵬等[11]在研究尖孢鐮刀菌的分裂機制時也驗證了碳化硅量子點的熒光標記長時程性。為此，本實驗對試樣菌液2進行長時間的培養(10～40 d)，間隔地對試樣取樣(15 d、30 d熒光成像)，觀察其是否也能滿足SiC量子點對串珠鐮刀菌標記的長時程成像，照相結果如圖5所示。

從串珠鐮刀菌活體細胞不同培養時間的長時程熒光成像結果中可以直觀看出，隨著對試樣培養時間的延長，SiC量子點已標記串珠鐮刀菌的熒光強度隨著該菌對溶液的不斷吸收、SiC量子點逐步滲入菌內而逐漸增強，使得在熒光顯微鏡下觀測到的該菌的數目和形態更加清晰；通過菌液2(含SiC量子點)與菌液1(無SiC量子點)對比，串珠鐮刀菌的菌落數量、分裂形態和發育機理等均未出現明顯差異，這表明該熒光標記材料幾乎無細胞毒性或毒性極小甚至可以忽略，完全不影響該菌的長發育過程，該試驗結果與Sahu等關于碳化硅量子點細胞毒性的研究結果完全一致[13]；同時，Bluet等研究團隊更為深入的研究并解釋了碳化硅量子點細胞無毒的原因，相比經表面修飾后的鎘系量子點其表面物理化學特性簡單，此外該量子點在對客體標記的過程中被標記客體吸收后以均勻的形式分布于活體細胞的。碳化硅量子點的無毒(或低毒)為其今后在活體細胞、靶向細胞甚至人體細胞的長時程成像奠定了生物學基礎。

3.4 根皮苷環境下串珠鐮刀菌的數量及分裂形態的變化

驗證了SiC量子點能夠成功實現對串珠鐮刀菌的長時程示蹤成像，深入研究串珠鐮刀菌生長速度及分裂形態與有無根皮苷環境的影響以及有根皮苷但其含量不同影響程度的變化狀況，經過對同一生長時期(培養20 d)的該菌在有、無根皮苷環境下試樣(菌液2、菌液3、菌液4)的取樣觀察對比，發現根皮苷環境下串珠鐮刀菌細胞數量出現較大變化，如圖6所示。

圖6a、6b、6c分別為菌液2、菌液3、菌液4三試樣培養15 d時的熒光成像結果(放大400倍)。從照相結果中可以看出，未添加根皮苷的菌液2的串珠鐮刀菌數目很少，而加入根皮苷的菌液3和菌液4的數量明顯較多。為了排除觀察視野的局限性，對三種試樣在熒光顯微鏡下縮小同樣倍數(放大200倍)后再次進行照相，其結果如圖6d、6e、6f所示，結果同樣表明未添加根皮苷的串珠鐮刀菌數量明顯少于添加了根皮苷的該菌，初步說明了根皮苷的添加在一定程度上促進了串珠鐮刀菌的生長。

考察根皮苷環境對串珠鐮刀菌數量影響的同時又發現，添加根皮苷的菌液試樣在生長分裂形態、強度方面有著更為顯著的特點，圖7即為不同菌液(菌液2、3、4)在相同培養條件下培養35 d時熒光顯微鏡照相結果。

圖7照相結果表明，包括初期的分生孢子生長成串珠菌落，進而形成團絮狀菌絲這一過程比起未添加根皮苷的串珠鐮刀菌菌落，其生長速度要快的多，并且在分裂形態上同樣有著較大的區別。這表明無論是在生長速度上或是分裂形態上，根皮苷為該菌提供了一個助長的環境。

將圖6a～c與圖7a～c兩組照相結果做作對比，不同的根皮苷含量對串珠鐮刀菌生長態勢的影響程度不盡相同，不難發現，1.0 mol/L根皮苷含量的生長環境下串珠鐮刀菌數量大于、分裂強度高于0.5 mol/L根皮苷含量的試樣。這表明隨著添加根皮苷含量的增加(一定范圍)，串珠鐮刀菌的數量、分裂強度呈上升趨勢。

圖6 不同根皮苷含量環境串珠鐮刀菌的數量變化(a)無根皮苷;(b)0.5 mol/L;(c)1.0 mol/L;(d)無根皮苷(較a縮小2倍);(e)0.5 mol/L(較b縮小2倍);(f)1.0 mol/L(較c縮小2倍)Fig.6 Number changes of fusarium moniliforme in different environments with different content of phloretin at thesame culture time (a)no phlorizin;(b)0.5 mol/L ;(c)1 mol/L;(d)no phlorizin (2 times smaller than a);(e)0.5 mol/L (2 times smaller than b);(f)1 mol/L (2 times smaller than c)

圖7 同一培養時間(35 d)不同根皮苷含量的串珠鐮刀菌分裂程度變化(a)無根皮苷;(b)0.5 mol/L;(c)1 mol/LFig.7 Change of fission degree of fusarium moniliforme with different content ofphloretin at the same culture time(35 d) (a)no phlorizin;(b)0.5 mol/L;(c)1 mol/L

3.5 串珠鐮刀菌對蘋果幼苗根部侵染過程

將經碳化硅量子點熒光標記材料穩定標記后的串珠鐮刀菌從菌液4(高含量的根皮苷助長了鐮刀菌的分裂生長，其吸收的熒光標記材料碳化硅量子點的量也相對較多，便于觀察該菌對宿主的侵染過程)中分離提純，然后將標記后的該菌無菌接種到宿主(蘋果植株幼苗)生長的培養液；對其在恒溫、無菌條件下長時間(約30 d)培養，并于每天對其取樣觀察，熒光顯微鏡下觀察不同時段(1 d、5 d、10 d、20 d)根部侵染情況并照相其結果如圖8所示。

對培養液接種后的蘋果幼苗培養1 d時取樣并在熒光顯微鏡下觀察，結果如圖8a所示，蘋果幼苗根毛附近發出微弱的熒光，這表明串珠鐮刀菌對幼苗的侵染已初步開始；5 d時，再次取樣觀察結果如圖8b所示，蘋果幼苗根毛區的熒光強度明顯加強，這表明根毛已經吸收了大量標記后的串珠鐮刀菌，并且已鎖定侵染宿主的初始位置為根毛區；10 d時后繼續取樣觀察結果如圖8c所示，蘋果植株幼苗根部的表皮細胞發出很強的熒光，這表明隨著培養時間的延長，根毛吸收的串珠鐮刀菌逐漸被該區表皮細胞所攝取；在培養時間達到20 d時，進行最后一次取樣，將根須的表皮去除做成切片進行觀察，結果如圖8d所示，切片在熒光顯微鏡下發出了劇烈的熒光，這表明串珠鐮刀菌已經進入到根須的細胞核，完成了對宿主的侵染。

圖8 串珠鐮刀菌對蘋果幼苗根部侵染過程的動態示蹤及成像(a)1 d(b)5 d;(c)10 d;(d)20 dFig.8 Dynamic tracing and imaging of the root of apple tree which infected by fusarium moniliforme(a)1 d;(b)5 d;(c)10 d;(d)20 d

圖9 串珠鐮刀菌對挫傷后蘋果植株幼苗根須的侵染熒光成像(培養5 d)Fig.9 Fluorescence imaging of the injuredroot of apple tree which infected by fusarium moniliforme(5 d cultivating after marked)

為驗證串珠鐮刀菌侵染宿主(蘋果幼苗植株根部為例)的開始位置確實從根毛區開始，在無菌條件下將培養1 d的蘋果幼苗根須人為挫傷后放入培養液繼續培養，5 d后將挫傷部分根須取樣后仍制以切片形式在熒光顯微鏡下觀察，結果如圖9所示。

圖中被人為挫傷的根須部分為橢圓所圈，而所圈發亮的部分則為串珠鐮刀菌因被量子點標記而在顯微鏡下發出強烈的熒光，很明顯該位置仍然是幼苗的根毛區，串珠鐮刀菌并沒有因為宿主傷口的存在而首先入侵至挫傷部位的表皮細胞，實驗結果與A. L. Lagopodi研究的結果完全一致[15]，因此有理由認為：根毛區是植株新陳代謝和吸收養分的重要部位，所以串珠鐮刀菌對宿主侵染的初始位置是根毛區。

4 結 論

(1)碳化硅量子點成為繼鎘系量子點后又一新型半導體標記材料，它不僅可以成功標記活體細胞，而且還能實現長時程成像與動態示蹤，為實時對細胞、活體內分子的動態監測，揭示生命活動規律提供理論基礎與技術支撐。

(2)串珠鐮刀菌在不同根皮苷含量生長環境長時間培養，其數量、形態、生理機能的變化表明根皮苷促進了串珠鐮刀菌的生長，并且隨著生長環境中根皮苷含量的增加，該菌的生長態勢更為旺盛；串珠鐮刀菌對蘋果幼苗侵染過程的動態示蹤表明，串珠鐮刀菌對蘋果幼苗根部侵染的初始部位是根毛區。

(3)利用碳化硅量子點熒光標記技術，初步研究了在親合狀況下串珠鐮刀菌侵染蘋果幼苗根部致病過程的組織學與細胞學特征，揭示了該菌的致病過程與機制，為抗病新品種、新型農藥等防治方法的研究提供了理論依據。