環氧合酶-2和磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶在扁平苔蘚皮損中的表達

王 娟 白 莉 趙一錦 鮑海平 米希婷

扁平苔蘚(lichen planus，LP)是一種T細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，發病機制尚未探明，既往研究發現皮損中角質形成細胞存在異常增殖與凋亡現象，血管密度增加[1-3]。環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是合成前列腺素的關鍵限速酶，多種應激和前炎性信號可誘導其表達，參與炎癥反應、細胞增殖分化、血管形成和腫瘤浸潤等病理過程。國外學者報道，皮膚扁平苔蘚皮損處COX-2mRNA和COX-2主要產物前列腺素E2(PGE2)的表達水平明顯高于非皮損處，同時皮損和非皮損處的表達均比正常皮膚組織顯著升高，認為COX-2和PGE2通過促進樹突狀細胞遷移、活化和激活Th1、Th17免疫應答系統，參與扁平苔蘚的發病[4]，目前國內未見相關報道。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)介導了COX-2表達與前列腺素合成的信號傳導，其家族成員P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)是調控COX-2表達的上游激酶。為研究扁平苔蘚皮損中COX-2及其上游調控分子的表達情況，我們對皮損中COX-2和p-P38MAPK的表達強度進行了檢測，探討其在扁平苔蘚發病中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 病例組20例，選自2016年1月至2017年12月就診于我院皮膚科的扁平苔蘚患者皮損標本，均經臨床和病理確診，包括男12例，女8例，年齡25～68歲，平均(37.94±3.86)歲，病程3～30個月，平均病程(15±4.7)個月。其中慢性局限性11例、線狀4例、泛發性3例、肥厚性2例。取材自四肢和軀干。同時半年內局部或全身未使用過糖皮質激素或免疫抑制劑類藥物，無其它皮膚病或系統疾病。對照組20例正常皮膚組織標本，均取自整形外科健康皮膚，男、女各10例，年齡21～66歲，平均(36.48±4.31)歲。兩組在性別、年齡上比較，差異均無統計學意義。

1.2 主要試劑 兔抗人COX-2單克隆抗體、兔抗人p-P38MAPK單克隆抗體(Cell Signaling公司)，即用型二步法檢測試劑盒PV-9000(GBI公司)，二氨基聯苯胺(DAB)試劑(Sigma公司)。

1.3 免疫組化法 步驟如下：石蠟標本連續切片至4 μm，脫蠟水化；3% H2O2溶液孵育25 min消除內源性過氧化物酶的活性；枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復；分別滴加稀釋的一抗：COX-2(1∶200)和p-P38MAPK(1∶250)，空白對照采用PBS代替一抗；滴加二抗試劑；然后DAB顯色，蘇木素復染、脫水、封片。

1.4 結果判定 以胞質或胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞。每張標本隨機選擇5個高倍視野(×400)，采用MIAS-2000圖像分析系統測定染色區域的積分光密度值(integrated optical density，IOD)，取均值為該標本的IOD值，由專人負責測定，測定前背景校正，保持每張標本參數設置一致。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，組間比較進行t檢驗，指標間相關性采用Pearson相關分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 免疫組化結果 COX-2陽性染色定位于胞質，p-P38MAPK定位于胞質和(或)胞核。在扁平苔蘚皮損中，COX-2和p-P38MAPK陽性細胞主要分布于表皮基底層和棘層，染色呈棕黃色，部分真皮淋巴細胞也有表達(圖1)；在正常皮膚組織中，二者均呈弱陽性或陰性表達(圖2)。兩組間IOD均值比較，差異均有統計學意義(表1)。

2.2 相關性分析 扁平苔蘚皮損中COX-2與p-P38MAPK的表達呈正相關(r=0.62，P<0.01)。

圖11a、1b分別為COX-2和p-P38MAPK在扁平苔蘚組織中的表達(免疫組化，×100)圖22a、2b分別為COX-2和p-P38MAPK在正常皮膚組織中的表達(免疫組化，×100)

表1 COX-2和p-P38MAPK在扁平苔蘚和正常皮膚的表達

3 討論

COX-2是花生四烯酸代謝過程中重要的限速酶，屬于誘生型蛋白酶，生理狀態下基本不表達，當細胞受到炎癥介質、致癌因子或生長因子刺激時表達上調[5]。研究發現上皮細胞的增殖離不開COX-2的調控[6]，在皮膚腫瘤、銀屑病和口腔扁平苔蘚皮損中都有COX-2的表達，不僅通過前列腺素等炎性因子參與炎癥反應，而且可上調血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)的表達，促進血管形成、細胞過度增殖[7-9]。在銀屑病、口腔扁平苔蘚皮損中均發現COX-2和VEGF的表達呈正相關[8，9]。筆者運用免疫組化法檢測扁平苔蘚皮損，發現COX-2的表達水平明顯高于正常皮膚組織，既往我們發現VEGF在皮損中亦高表達，二者表達位置一致[2，3]，提示COX-2和VEGF可能存在正向調控關系，共同參與了扁平苔蘚的發病，推測在炎癥環境下，COX-2表達增多，通過其催化產物PGE2參與局部炎癥反應、促進角質形成細胞增殖分化，同時上調VEGF表達，促進新生血管形成，加重炎細胞浸潤，為過度增殖的角質形成細胞提供營養供給。

MAPK是細胞內一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，激活后經胞內一系列蛋白磷酸化修飾引起酶的級聯反應，將細胞外刺激信號傳導至細胞及其核內，調節細胞周期運行和炎癥反應，其介導的信號通路是細胞分裂增殖最重要的途徑之一。P38MAPK是MAPK家族的主要成員之一，在靜止細胞內，以非活化的形式存在于細胞質與(或)細胞核，一旦被磷酸化激活，即移位于細胞核，控制多種轉錄因子的基因表達。本研究發現p-P38MAPK在正常皮膚組織的表皮細胞胞質和胞核少量表達，而在扁平苔蘚皮損中表現出明顯的親核性，大量表達于胞核，提示其介導的信號通路被激活，發揮生物學效應。

研究發現P38MAPK信號系統可通過控制轉錄，上調COX-2的表達，磷酸化的P38MAPK是介導信號傳遞的活性物質，抑制P38MAPK活化可減輕COX-2介導的炎癥反應[10]。一方面活化的P38MAPK入核后激活NF-κB，后者通過與COX-2啟動子相應位點結合，啟動COX-2基因的擴增[11]；另一方面，P38MAPK尚可通過調節活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)促進COX-2基因轉錄，抑制NF-κB和AP-1的活性均可拮抗COX-2的表達[12]。筆者發現在扁平苔蘚中COX-2和p-P38MAPK的表達呈正相關，提示COX-2的表達可能受到上游P38MAPK信號系統的調控，二者協同作用，我們推測在扁平苔蘚發病中，外界刺激信號激活P38MAPK信號系統，經胞內一系列酶聯反應，將信號傳入核內，激活核轉錄因子NF-κB、AP-1，繼而促進COX-2、cyclinD1等基因的表達，參與皮損中炎癥反應進程和角質形成細胞的異常增殖，導致扁平苔蘚病變的產生。但是COX-2的表達受多個信號通路調控，可能具有組織和細胞特異性，故扁平苔蘚中COX-2的表達調控機制尚需進一步研究。