tuf基因同源超表達對植物乳桿菌LR-1生理行為的影響

劉 蕾，厙 曉，錢 楊，李婭琳，聶 蓉，饒 瑜*

（西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039）

隨著人們的健康意識日益增強，益生菌因其益生功效而獲得越來越多的關注。聯合國糧農組織和世界衛生組織于2002年將益生菌定義為“一類達到足夠數量時可對宿主產生有利作用的活的微生物”。其中植物乳桿菌是應用最為廣泛的益生菌之一。臨床研究表明，植物乳桿菌對胃腸道疾病（如應激性結腸綜合征、炎性腸病、腹瀉等）及變應性疾病（如特應性皮炎等）等方面具有積極的治療效果[1-3]。然而，關于植物乳桿菌基因功能的解析尚顯不足，且多集中在異源表達相關蛋白再進行分析。此外菌劑在應用及制備過程中，受到不良環境的脅迫。因此，需要其能夠抵御脅迫環境從而保證活性，且能夠在保存和運輸過程中保持穩定。目前主要通過優化益生菌劑的保護壁材、添加輔劑等工程手段來提升菌株的抗脅迫能力[4-5]。關于如何從菌株自身的生理特性及基因特征角度來增強其抗性能力尚處于起步階段。

tuf基因編碼熱不穩定延伸因子（elongation factor thermo unstable，EF-Tu），在細菌中是豐度最高的蛋白之一，參與蛋白質合成最關鍵的步驟。此外，EF-Tu還具有諸多其他功能，參與細菌其他生理行為[6-7]。研究表明，Francisella novicida的EF-Tu可以促發巨噬細胞的炎癥細胞因子[8]，然而Leptospira spp.的EF-Tu可以與血纖維蛋白溶原酶及補體因子H結合，從而導致組織浸潤和補體失活[9]。在Vibrio parahaemolyticus中EF-Tu被認為是新的毒力因子[10]，而在Staphylococcus aureus中EF-Tu因其細胞質或表面定位而表現出多種功能，與菌體對宿主組織的定植、存留和侵襲有關[11]。Gallibacterium的EF-Tu可能參與其生物被膜形成，與致病性有關。在益生菌領域，相關研究較為匱乏[12]。其中Lactobacillus reuteri的EF-Tu可以與豬胃黏液素結合，從而促進細菌黏附于黏膜表面[13]。然而，與諸如大腸桿菌、沙門氏菌、酵母菌等工程菌相比，益生菌的基因工程操作元件相對較少，技術平臺相對不成熟，這也限制了益生菌的同源基因工程操作分析及基因重組菌劑的開發。

在此背景下，本研究采用同源超表達及電轉化技術，構建植物乳桿菌tuf基因超表達重組菌株，對重組菌株的生長情況、抗脅迫能力、黏附能力及生物被膜形成能力進行分析，并檢測tuf基因超表達對其他基因的轉錄水平有何影響。本研究為進一步研究乳桿菌基因功能，從基因改造角度開發更高效的菌劑提供新的思路和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與細胞

LR-1分離自四川發酵泡菜，經16S rDNA測序鑒定為一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），命名為植物乳桿菌LR-1；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購于寶生物工程（大連）有限公司；HT-29細胞，由本實驗室保存。

1.1.2 培養基

乳酸菌培養用培養基：MRS培養基，包括蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，牛肉浸膏10 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 mL/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L。

大腸桿菌培養用培養基：LB培養基，包括胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調節pH值至7.4，121 ℃滅菌15 min后備用。

1.1.3 試劑

R010Q PrimeSTAR HS DNA Polymerase、RR001A Ex Taq、6011 pMD 18-T Vector Cloning Kit 寶生物工程（大連）有限公司；EL0021 T4 DNA連接酶、RNasefree DNase I、RNase抑制劑以及DMEM（Dulbecoo's Modified Eagle Medium） 美國Thermo Scientific公司；DP209普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DP107高純度質粒小提中量試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；反轉錄試劑盒TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit和TRIpure 北京艾德萊生物科技有限公司；胰酶-0.02%EDTA消化液 上海碧云天生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司。

20%甘氨酸貯液：20 g 甘氨酸，溶于100 mL去離子水，高壓滅菌，常溫避光保存；MRSS（MRS，0.3 mol/L蔗糖）：10.269 g蔗糖溶于100 mL MRS，滅菌待用；MRSSM（MRS，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mol/L MgCl2）：10.269 g蔗糖和 2 g MgCl2溶于100 mL MRS，滅菌待用；Washing Buffer（0.3 mol/L蔗糖，0.1 mol/L MgCl2）：0.269 g蔗糖和2 g MgCl2溶于100 mL去離子水中，滅菌待用；30%聚乙二醇-1500（polyethylene glycol-1500，PEG-1500）：15 g PEG-1500水浴加熱溶化后，溶于50 mL去離子水中，采用0.22 μm無菌濾器除菌，4 ℃保存。

1.2 儀器與設備

3K15低溫高速離心機 德國Satorious公司；AIRTECH-SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；Tanon 1600全自動數碼凝膠圖像分析系統上海天能科技有限公司；KF960聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 杭州晶格科學儀器有限公司；MicroPulser電轉化儀/電穿孔儀 美國Bio-Rad公司；FQD-96A實時定量聚合酶鏈式反應（quantification real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）檢測系統 杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 穿梭重組質粒tuf-pMD18T的構建

提取植物乳桿菌LR-1的基因組，以基因組為模板，擴增菌株LR-1的tuf基因。擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。將tuf基因膠回收產物與pMD18T載體進行連接，連接體系（10 μL）如下：tuf基因膠回收產物4 μL，pMD18T 1 μL，Solution I 5 μL。連接溫度16 ℃，連接時間2 h。連接結束后將連接產物化學轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，后培養于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板中，37 ℃培養至肉眼可見單克隆菌落。挑取單克隆菌落，置于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養12 h，進行菌液PCR鑒定并篩選陽性單克隆菌落。將篩選的陽性菌株接種至含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養12 h，采用高純度小提中量質粒提取試劑盒提取質粒tuf-pMD18T。將提取的質粒進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 過表達重組質粒tuf-pMG76e的構建

將重組質粒tuf-pMD18T進行XbaI/XhoI雙酶切，并對tuf基因片段進行切膠回收。同時將質粒pMG76e（由中國農業大學陳尚武教授及李平蘭教授友情饋贈）進行XbaI/XhoI雙酶切，并對線性化的質粒pMG76e片段進行切膠回收。將二者進行連接，連接體系（10 μL）為：tuf基因片段4 μL，質粒pMG76e 1 μL，Solution I 5 μL。連接溫度16 ℃，連接時間2 h。連接結束后將連接產物化學轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。轉化完成后將菌株均勻涂布于含有200 μg/mL紅霉素的LB固體平板中，37 ℃培養48 h。挑取單克隆菌落進行培養，進行菌液PCR鑒定，使用引物為76e-F/R，擴增體系和擴增步驟同上所示。之后進行瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性克隆。將陽性菌株接種至含有200 μg/mL紅霉素的LB液體培養基中進行擴大培養，提取質粒，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對檢測合格的質粒進行再次雙酶切鑒定，檢測合格后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 感受態細胞的制備

將500 μL 20%甘氨酸貯液加到9.5 mL MRSS中，即為L-ZS9感受態培養基。以1%（體積分數）接種量將植物乳桿菌LR-1接種至以上培養基中，待菌生長至OD600nm達到0.5。將培養好的菌液至于10 mL離心管中，6 000 r/min、4 ℃離心8 min，收集菌體；去上清液，加入2 mL Washing Buffer洗滌沉淀，6 000 r/min、4 ℃離心8 min，收集菌體；重復此步驟；去上清液，加入2 mL 30% PEG-1500重懸后，6 000 r/min、4 ℃離心10 min；去上清液，加入200 μL 30% PEG-1500重懸，每管40 μL，置于冰上待用。

1.3.4 tuf同源過表達重組菌株的構建及鑒定

采用電轉化將構建好的含有tuf基因的重組質粒導入植物乳桿菌LR-1感受態細胞，構建EF-Tu同源過表達重組菌株。具體方法如下：將4 μL LR-1感受態細胞轉移到2 mm電擊杯中，點擊檢測是否爆杯，如果正常，作為對照組；分別將空載體pMG76e質粒和重組質粒tuf-pMG76e DNA（2 μL）與40 μL感受態細胞的混合后置于冰上（加質粒量不要超過總體積的1/20）轉移到2 mm電擊杯中，置于冰上5 min，并確定沒氣泡；設定點擊程序1.5 kV，25 μL，400 Ω；進行點擊后，冰上靜置5 min；加入1 mL MRSSM復蘇培養基，轉移到1.5 mL離心管中，37 ℃培養2 h；將復蘇的菌液7 000 r/min、常溫離心2 min，去除850 μL上清液后，涂布于含3 μg/mL紅霉素的MRS平板，37 ℃培養 36～48 h。

之后通過pMG76e鑒定引物進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳對轉化子進行初步鑒定。分別挑取轉化子單克隆于含有3 μg/mL紅霉素的MRS液體培養基中，靜置培養16～18 h后，吸取100 μL培養菌液，10 000 r/min離心2 min，去除上清液，加入100 μL無菌水重懸菌泥，離心去除上清液，重復該步驟一次，之后用20 μL無菌水重懸菌泥，此為PCR擴增體系模板，置于-20 ℃備用。后進行PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測，空載體導入菌株為陰性對照，擴增引物序列為76F：5’-TTCGGTCCTCGGGATATG-3’；76R：5’-CTGTCTTGGCCGCTTCAA-3’。

1.3.5 tuf基因轉錄水平測定

通過qRT-PCR對tuf過表達重組菌株的tuf基因轉錄水平進行測定，以進一步鑒定tuf過表達重組菌株的構建是否成功。將植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導入菌株和tuf過表達重組菌株接種于MRS培養基中，至37 ℃靜置培養8 h。培養完成12 000×g離心收集菌體，液氮研磨，加TRIpure，置于-80 ℃凍存。參照北京艾德萊生物科技有限公司的TRIpure提取步驟提取總RNA。cDNA的合成參照該公司TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行，方法如下：總RNA 50 ng～5 μg，隨機引物1 μL，5×RT Reaction Mix 4 μL，TUREscript H-RTase 1 μL，之后用RNase free H2O定容至20 μL。25 ℃孵育10 min，之后42 ℃孵育30～50 min，65 ℃加熱15 min以失活TUREscript H-RTase。DNaseI處理合成的cDNA后，置于-80 ℃待用。以16S rRNA為內參基因，采用Primer 3 Input（version 0.4.0）設計引物，用于進行qRT-PCR。引物序列如下：tuf-F：5’-GACCGCTGCAATCACTAAGG-3’；tuf-R：5’-GAGCGGCACCAGTAATCATG-3’。

qRT-PCR體系（20 μL）：1 μL模板cDNA，10 μL 2×Sybgreen，上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol/L），以及7 μL無RNase水。擴增程序為：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個循環。采用Livak法進行數據分析。

1.3.6 生長曲線測定

將植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導入菌株和tuf過表達重組菌株以1%接種于MRS培養基中，37 ℃靜置培養36 h，分別在3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h收集培養液，測定OD600nm，繪制生長曲線。

1.3.7 耐熱、耐酸、耐膽鹽能力檢測

分別將植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導入菌株和tuf過表達重組菌株進行活化。將收集到的菌體置于80 ℃水浴鍋中，處理3 min，進行耐熱實驗。將收集到的菌體分別重懸于pH值為2.8的MRS培養基中，處理1 h，進行耐酸實驗。將收集到的菌體分別重懸于含膽鹽0.2 g/100 mL的MRS培養基中，處理0.5 h，進行耐膽鹽實驗。處理結束后通過平板活菌計數法計算活菌數。實驗每組設3個平行，且進行3次生物學重復。分別確定以上菌株的耐熱、耐酸和耐膽鹽能力。存活率計算如式（1）所示：

1.3.8 黏附能力檢測

將植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導入菌株和tuf過表達重組菌株接種于MRS培養基中進行活化，5 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗滌菌體，并重懸至終濃度1×108CFU/mL。

將HT-29細胞接種于24 孔細胞培養板中，待其長滿單層后（每孔約含2.5×105個細胞），每孔接種100 μL上述收集的細菌懸液，輕微晃勻后置于37 ℃培養1.5 h，棄培養液，PBS洗滌5 次，加100 μL的0.1%胰酶-0.02% EDTA室溫處理10 min，消化細胞，再加900 μL DMEM，并用巴氏吸管吹打，取100 μL混合液進行10 倍稀釋，各稀釋度取100 μL接種于MRS平板，37 ℃培養，記錄菌落數，實驗每組設3 個平行，且進行3 次生物學重復。黏附率計算如式（2）所示：

1.3.9 生物被膜量檢測

生物被膜形成能力檢測采用結晶紫染色法。將活化的植物乳桿菌LR-1野生株、空載體pMG76e導入菌株和tuf過表達重組菌株接種于MRS培養基中，將培養液加至96 孔細胞培養板中，每孔200 μL，37 ℃靜置培養36 h。培養結束后用PBS輕柔沖洗3 次，去除懸浮菌體，室溫晾干。每孔加0.1%結晶紫溶液，室溫染色30 min，無菌水輕柔沖洗至洗液無色為止，室溫晾干。加100 μL無水乙醇充分溶解結晶紫，檢測OD595nm值。

1.3.10 其他基因轉錄水平的測定

按照1.3.5節提取LR-1野生株、空載體pMG76e導入菌株和tuf過表達重組菌株的總RNA，通過qRT-PCR對相關基因轉錄水平進行測定。根據前期研究選定與乳桿菌抗脅迫能力、黏附能力及生物被膜形成能力相關的目標基因，分別為果糖-二磷酸醛縮酶編碼基因fba、甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼基因gap、磷酸甘油酸變位酶編碼基因pgm、核糖激酶編碼基因rib和S-核糖高半胱氨酸酶編碼基因luxS。

以16S rRNA為內參基因，采用Primer 3 Input（version 0.4.0）設計引物，用于進行qRT-PCR。引物名稱及序列如表1所示。1.4 數據分析

表 1 熒光定量PCR引物設計Table 1 Primers used for real-time PCR

所有測試重復進行平行實驗3次，用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析（ANOVA）及作圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 同源超表達重組菌株tuf基因轉錄水平分析

圖 1 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig. 1 Identification of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1 by PCR and agarsose gel electrophoresis

如圖1所示，11號條帶理論全長231 bp，tuf基因全長1 188 bp，1～10號條帶理論全長1 419 bp，與Marker對比可見，實際條帶大小均位于合理位置。PCR鑒定結果初步表明，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1構建成功。

重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的tuf基因轉錄水平檢測結果如圖2所示，空載體導入菌株pMG76e-LR-1與野生型菌株LR-1相比，tuf基因的轉錄水平無明顯差異，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的tuf基因轉錄水平平均上約調105 倍，表明菌株tuf-pMG76e-LR-1的tuf基因轉錄水平顯著上調。

圖 2 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的tuf基因轉錄水平Fig. 2 Transcription of tuf in recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

2.2 tuf超表達對菌株生長的影響

圖 3 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的生長曲線Fig. 3 Growth curve of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

由圖3可知，空載體導入菌株pMG76e-LR-1與野生型菌株LR-1的生長情況較為一致，表明空載體pMG76e的導入不影響菌株LR-1的生長。同時，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的生長曲線表明，其早期的生長情況稍慢于空載體導入菌株pMG76e-LR-1與野生型菌株LR-1，但最終的菌懸液濃度與其余兩者一致。結果表明，tuf基因超表達在早期對菌株LR-1的生長有輕微抑制，但不影響最終菌株LR-1的生長情況。

2.3 tuf超表達對菌株抗脅迫能力的影響

圖 4 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的耐熱能力分析Fig. 4 Heat resistance of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

通過對菌株tuf-pMG76e-LR-1、pMG76e-LR-1和LR-1的耐熱能力進行檢測，結果如圖4所示，與野生型LR-1菌株相比，經熱處理后，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的存活率上調至約2.75 倍。該結果說明tuf基因的超表達可增強菌株LR-1的耐熱能力。此外，tuf基因超表達對菌株LR-1的耐酸能力和耐膽鹽能力沒有顯著影響（本文中未顯示該結果）。

乳酸菌在開發為發酵菌劑或益生菌劑的過程中常常要經歷各種脅迫環境，如噴霧干燥法的高溫環境[14-15]。有研究表明tuf基因編碼的EF-Tu為耐熱延伸因子，對熱極其穩定，80 ℃、5 min處理原活性僅丟失50%[16]。研究表明該蛋白參與哺乳動物細胞從轉錄到翻譯熱應激的全部過程[17]。對tuf基因表達情況對菌株耐熱性能的影響進行研究，結果表明tuf基因過表達會顯著增強植物乳桿菌LR-1的耐熱能力，與EF-Tu在其他菌株的相關研究結果一致。

2.4 tuf超表達對菌株黏附能力的影響

圖 5 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的黏附能力分析Fig. 5 Adhesion ability of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

由圖5可知，菌株LR-1對HT-29細胞具有一定的黏附能力，且pMG76空載體的導入會對其黏附能力起抑制作用，而tuf-pMG76e重組質粒的導入會增強菌株的黏附能力，使黏附率平均上調至約1.6 倍。結果表明，tuf基因的超表達可以增強菌株LR-1的黏附性能。

有研究表明EF-Tu是一個黏附相關因子，Paracoccidioides brasiliensis的延伸因子EF-Tu與其對宿主的黏附和侵襲相關[18]。最新的研究結果發現該蛋白可作為Mycoplasma hyopneumoniae表面的黏附素，通過與纖粘蛋白結合從而發揮多種作用[19]。對于Helicobacter pylori來說，EF-Tu在致病機理中扮演者潛在黏附因子的重要角色[20]乳桿菌的相關研究發現，Lactobacillus的EF-Tu在菌株黏附時發揮重要作用，它還參與調控其對腸道病原菌的抑制作用[21]。Lactobacillus acidophilus ATCC 4356的EF-Tu也是一個黏附相關因子[22]。菌株L. plantarum 423的EF-Tu參與調控其對Caco-2細胞的黏附作用[23]。最新的研究結果發現該蛋白可作為Mycoplasma hyopneumoniae表面的黏附素，通過與纖粘蛋白結合從而發揮多種作用[19]。本研究結果與以上研究結果一致，且通過構建同源重組菌株并直接檢測其黏附能力，表明tuf基因的表達情況與植物乳桿菌LR-1的黏附性能呈正相關，且超表達重組菌株tuf-pMG76e-LR-1自身的黏附能力增強。這提示研究人員益生菌tuf基因超表達重組菌株可能具有更強的體內黏附定植能力，對于其更好的益生功效具有重要價值，具體研究需要進一步動物實驗進行驗證。此外，空載體pMG76e導入菌株的黏附能力較野生菌株LR-1有所下降，可能是由于感受態制備及電轉化過程對菌體細胞本身黏附性能造成影響，或者空載體在菌體中復制對菌體細胞黏附性能產生干擾，具體原因尚不明確，有待進一步研究。

2.5 tuf超表達對菌株生物被膜形成能力的影響

圖 6 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1的生物被膜形成能力分析Fig. 6 Biofilm formation of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1

如圖6所示，菌株LR-1具有較強的被膜形成能力，與野生型菌株的被膜形成量相比，空載體導入菌株pMG76e-LR-1無顯著差異，而重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的被膜形成量增多，且在統計學意義上具有極顯著差異。結合2.2節研究結果，表明菌株培養36 h后，在tuf基因超表達不會影響菌株最終生長量的情況下，會顯著增強菌株LR-1的生物被膜形成能力。

益生菌的生物被膜研究處于起步階段，前期研究曾對類植物乳桿菌L-ZS9的生物被膜態生理行為進行過分析，發現被膜態的菌體具有更強的抗脅迫能力及黏附能力[24-25]，因此選擇被膜形成作為一個重要檢測指標。目前關于稱延伸因子EF-Tu調控生物被膜的形成的研究較為少見，Gallibacterium的EF-Tu具有淀粉樣性質，存在于生物被膜中[12]。前期研究曾發現類植物乳桿菌L-ZS9的EF-Tu與菌株的生物被膜形成有關[26]。本研究與之前研究結果一致，植物乳桿菌LR-1的tuf基因表達量增高，可以增強菌株的被膜形成能力。其具體作用機制尚不明確，結合2.5節研究結果進行分析，這可能是由于EF-Tu與黏附能力有關，且EF-Tu有可能是乳桿菌的一種黏附因子，其表達量增高可以增強菌株的固附著能力。

2.6 EF-Tu超表達對菌株其他基因轉錄水平的影響

基于前期研究結果[24-26]，本研究選擇與乳桿菌抗脅迫能力、黏附能力及生物被膜形成能力相關的基因fba、pgm、gap、rib和luxS作為檢測基因，以空載體導入菌株pMG76e-LR-1為對照菌株，對重組菌株tuf-pMG76e-LR-1以上基因的轉錄水平進行檢測。如圖7所示，重組菌株tuf-pMG76e-LR-1的基因fba、pgm、gap、rib和luxS轉錄水平均上調表達，其中luxS基因上調表達約47 倍，gap基因上調表達約48 倍，fba基因上調表達約56 倍，pgm基因上調表達約80 倍，rib基因上調表達約305 倍，上調倍數最為顯著。

圖 7 重組菌株tuf- pMG76e-LR-1和pMG76e-LR-1的基因轉錄水平比較Fig. 7 Comparison of genes transcription of recombinant strain tuf-pMG76e-LR-1 and pMG76e-LR-1

糖酵解途徑作為大多數生物所共有的基本代謝途徑，在有氧和無氧條件下均能進行，且是糖代謝和脂類代謝的連接點，因此該代謝途徑的改變對微生物生理行為具有重要影響。本研究中pgm基因編碼磷酸甘油酸變位酶，fba基因編碼果糖-二磷酸醛縮酶，gap基因編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以上3 個基因參與微生物的糖酵解途徑。前期結果表明乳桿菌中的pgm、fba和gap基因表達情況與生物被膜形成呈正相關[26]。也有研究發現菌株Saccharomyces cerevisiae的糖酵解代謝途徑會影響其生物被膜形成[27]，菌株Listeria monocytogenes的被膜狀態中糖酵解途徑相關蛋白發生上調[28]，此外，生物被膜形成能力與黏附能力密切相關[29-30]。結合本研究結果可推測，tuf基因的超表達會誘導三者表達量的上調，說明tuf基因可能通過代表菌株LR-1的糖酵解效率來調控生理行為。

luxS基因編碼S-核糖高半胱氨酸酶，是細菌II型群體感應系統信號分子的關鍵合成基因，該基因表達情況的改變常會影響細菌諸多生理行為的變化[31-33]。關于乳桿菌luxS的相關研究相較病原菌尚顯不足。目前研究表明L. plantarum KLDS1.0391中luxS與菌株脅迫耐受和黏附能力有關[31]。信號分子AI-2對L. acidophilus黏附能力也有重要影響[34]。LuxS代謝對于Lactobacillus rhamnosus GG的胃腸道耐受能力非常關鍵[35]。luxS基因的缺失會影響Lactobacillus reuteri 100-23的一些其他生理行為[36]。Lactobacillus spp.的酸應激會誘發AI-2信號通路[37]。以上研究均表明luxS基因參與乳桿菌的抗脅迫、黏附以及其他生理行為。此外，Lactobacillus paraplantarum L-ZS9的luxS基因超表達對會顯著增強菌株的生物被膜形成能力[26]。基于以上研究，本研究結果表明菌株LR-1的tuf超表達菌株相關生理行為的改變可能是通過luxS表達水平上調來調控的。rib基因編碼核糖激酶，核糖激酶參與核糖代謝，與物質循環及遺傳信息的合成有關，也是菌株初級代謝的重要調控基因。此外，前期研究也發現rib基因與菌株的生物被膜形成有關[26]。因此，選擇以上5 個基因作為檢測對象，發現tuf基因的上調會顯著增強以上5 個基因的表達，以上研究與本研究2.4、2.5節研究結果結合分析，表明tuf基因有可能通過上調以上基因來增強菌株LR-1的抗脅迫能力、被膜形成能力及黏附能力。

3 結 論

本研究通過電轉化構建植物乳桿菌LR-1的tuf基因同源超表達重組菌株，并對其生長能力、抗脅迫能力、黏附能力及被膜形成能力進行分析，結果表明tuf基因超表達對菌株LR-1的生長情況無非常的顯著影響，但是可以增強其耐熱性能、黏附能力及生物被膜形成能力。進一步通過qRT-PCR對糖酵解途徑參與基因、II型群感關鍵基因及核糖激酶編碼基因fba、pgm、gap、luxS和rib的轉錄水平進行檢測，發現tuf基因超表達可誘導以上基因上調表達，為tuf基因超表達調控植物乳桿菌LR-1生理行為的分子機制提供參考。本研究為乳桿菌的基因功能分析及挖掘具有價值，同時為基因工程菌株在發酵菌劑或益生菌劑的開發應用提供了理論支持。