布拉酵母高密度發酵培養基及發酵工藝優化

劉開放，席志文，黃林娜，惠豐立*

（南陽師范學院生命科學與技術學院，河南 南陽 473061）

布拉酵母（Saccharomyces boulardii）屬于釀酒酵母亞種[1]，具有降解毒素、調節腸道菌群和增強消化道免疫等功能，已被臨床用于治療腹瀉等疾病[2-4]。布拉酵母在動物養殖中也表現出良好效果，作為飼料添加劑在很多國家均通過了相關認證[6-8]，在畜牧業中應用前景廣闊。但布拉酵母高密度培養產量低、價格昂貴，市場上含有1.3×109CFU的布拉酵母菌粉售價約為40～45 元，這也限制布拉酵母推廣應用。因此優化布拉酵母高密度發酵培養基及發酵工藝，對促進布拉酵母的推廣應用具有重要意義。

高密度培養核心在于為菌體提供合適的營養成分和生長條件。目前針對布拉酵母及釀酒酵母屬的培養基優化主要采用單因素、正交設計和響應面優化法（response surface methodology，RSM）等方法[9-12]。但酵母菌在發酵過程中需要多種營養成分，各成分間的相互作用復雜，具有高度的非線性，傳統優化方法在處理非線性問題時具有一定局限性。而人工神經網絡（artificial neural network，ANN）能夠反映復雜的非線性關系，表現出很強的非線性映射能力，適用于非線性問題的建模、估計和預測[13-18]。遺傳算法（genetic algorithm，GA）具有全局尋優能力，可對模型進行全局性的訓練和優化，獲得最優方案[19-22]。本研究通過ANN與GA相結合，優化獲得最優培養基。在此基礎上，對影響布拉酵母菌生長的多種因素進行優化，建立適宜的高密度培養條件，為布拉酵母的推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii）為實驗室保存菌種。

1.1.2 培養基

斜面培養基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20 g/L、自然pH值。

種子培養基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、自然pH值。

初始發酵培養基：葡萄糖40 g/L、硝酸鉀14 g/L、蛋白胨45 g/L、玉米漿15 g/L、酵母營養鹽3 g/L、磷酸二氫鉀0.6 g/L、硫酸鎂0.8 g/L、自然pH值。

1.2 儀器與設備

ZHWY-200B型全溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；CT14RD11臺式離心機 上海天美生化儀器設備有限公司；FR124CN型分析天平 奧豪斯儀器有限公司；SGD-IV型還原糖測定儀 山東省科學院生物研究所；GS-F2001-MM 1 L四聯體玻璃發酵罐、50 L發酵罐上海顧信生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

搖瓶培養：經斜面培養基活化后，取一環轉接至種子培養基中，30 ℃、220 r/min培養12 h后獲得種子液。以8%接種量接種至發酵培養基中，自然pH值，30 ℃、220 r/min培養24 h。

發酵罐培養：初始裝液量為60%，流加1 mol/L的氫氧化鈉和鹽酸溶液維持pH值，接種量、溫度、pH值、溶氧水平等條件根據實驗情況決定。

1.3.2 指標測定

菌體布拉酵母產量的測定：取一定量將發酵液于8 000 r/min離心5 min去上清液，用生理鹽水洗滌菌體2 次，于105 ℃烘干至恒質量后稱質量。

葡萄糖質量濃度利用全自動還原糖測定儀測定；氨氮質量濃度采用甲醛法測定[23]。1.3.3 發酵培養基的確定

1.3.3.1 顯著因素篩選及中心組合設計（central composite design，CCD）試驗

在前期實驗基礎上，篩選得到葡萄糖（A）、硝酸鉀（B）、蛋白胨（C）、玉米漿（D）、酵母營養鹽（E）、磷酸二氫鉀（F）、硫酸鎂（G）7 種培養基組分，借助Minitab16軟件采用N為12的Plackett-Burman試驗設計篩選顯著因素[24-26]。CCD與Box-Behnken試驗相比，對各因素的取值范圍更廣，為提高優化精確度，借助Design-Expert 8.0對顯著因素進行CCD試驗。

1.3.3.2 RSM模型的建立

借助Design-Expert 8.0.6軟件，對相應數據進行RSM分析，并模擬出關于布拉酵母產量和培養基組分關系的回歸方程模型。此外，使用方差（R2）、均方根誤差（root mean squared error，RMSE）和預測標準誤差（standard error of prediction，SEP）對該模型的擬合精度和預測精度進行評估[27-28]，其計算見式（1）～（3）：

式中：Yi,e為實驗值；Yi,p為模型預測值；n為實驗組數；為實驗平均值。

1.3.3.3 ANN模型的建立

通過MATLAB 7.8軟件將顯著因素質量濃度作為ANN的輸入值、菌體布拉酵母產量為輸出值，運用反向傳播方法建立3 層ANN模型。tansig函數和purelin函數分別作為隱含層傳遞函數和輸出層傳遞函數，訓練函數為trainlm函數，并對模型的擬合精度和預測精度進行評估。

1.3.3.4 GA尋優獲得最優配方

將訓練完畢的較優模型作為GA的擬合函數，通過MATLAB 7.8軟件中GA工具箱搜尋輸入及輸出變量的最優解[28]。具體過程包括：采用二進制編碼將各變量的參數集進行編碼；確定群規模大小，選擇雜交、變異方法和交叉、變異的概率等參數，隨機產生初始種群；適應度評價；判斷是否滿足終止條件，如不滿足則進行循環，直到滿足條件；輸出GA最優解。

1.3.4 發酵工藝優化和放大培養

以布拉酵母菌體產量為考察對象，利用1 L四聯體發酵罐對溫度、接種量、pH值、溶氧等發酵條件進行優化，繪制其生長曲線。在此基礎上進行流加培養，控制發酵過程中的糖含量和氨氮含量，直至發酵結束。在前期高密度發酵培養基和發酵工藝優化的基礎上，利用50 L發酵罐放大培養，并對發酵過程中菌體布拉酵母產量、葡萄糖和氨氮含量變化進行監控。

1.4 數據處理

每組實驗均進行3 次平行測定，用借助Minitab 16和Design-Expert 8.0對數據進行統計分析。P＜0.05，表明具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 培養基優化結果及分析

2.1.1 Plackett-Burman試驗結果

對發酵基礎培養基中的7 種成分葡萄糖、硝酸鉀、蛋白胨、玉米漿、酵母營養鹽、磷酸二氫鉀、硫酸鎂質量濃度進行顯著因素篩選，結果見表1，各因素分析見表2。

表 1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Plackett-Burman design with experimental results g/L

表 2 各因素影響的主效應分析Table 2 Analysis of main effects of medium components

由表2可知，培養基各組分對布拉酵母產量影響顯著性次序為：葡萄糖＞蛋白胨＞玉米漿＞硝酸鉀＞酵母營養鹽＞硫酸鎂＞磷酸二氫鉀。P＜0.05，在95%的置信區間內對發酵模型影響顯著，其中葡萄糖、蛋白胨和玉米漿的P值小于0.05，其余因素的P值大于0.05。回歸方程為：Y=5.182 2+0.727 8A+0.218 9B+0.515 5C+0.411 1D-0.130 0E+0.007 8F+0.102 3G。模型P值為0.006，R2=97.2%，表明擬合程度較好，因此確定葡萄糖、蛋白胨和玉米漿為顯著因素并進行CCD試驗。

2.1.2 RSM模型建立及分析

借助Design-Expert 8.0.6軟件，對表3數據進行RSM分析，并獲得模擬回歸方程，結果見表4。

表 3 CCD試驗設計與結果Table 3 Central composite design with experimental and predicted results g/L

該模型的回歸方程Y1=7.53-0.59A+0.058C+0.76D-0.19AC+0.53AD-0.62CD-0.53A2-0.29C2-0.93D2。從表4可以看出，P＜0.05，說明該項在95%的置信區間內顯著，失擬項P值小于0.000 1，說明該模型對布拉酵母發酵過程的模擬能力較差，不能準確反映布拉酵母產量預測值與試驗值之間的關系。

表 4 RSM方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic regression model

2.1.3 ANN模型及分析

以CCD數據作為樣本，使用trainlm算法對神經網絡進行訓練。采用反向傳播方法建立ANN模型。為防止過度擬合，在保證訓練精度的情況下，盡量減少中間隱含層數量，訓練后比較發現，當隱含層神經元為6時，能對實驗數據準確擬合。所以本實驗選擇拓撲結構為3-6-1的神經網絡。由圖1可以看出，經過200 次迭代后網絡收斂精度達到10-2，樣本訓練能較快達到收斂。

圖 1 BP神經網絡訓練過程Fig. 1 Training course of BP neural network

2.1.4 RSM模型和ANN模型的對比

圖 2 ANN和RSM模型預測產量與實驗值對比Fig. 2 ANN and RSM prediction versus experimental values

由圖2可以看出，ANN模型的預測值與實驗值的擬合程度較好，RSM模型的預測值則更多地分散于實驗值附近。為進一步比較建立RSM模型和ANN模型的擬合能力、預測能力，分別計算2 個模型的R2、RMSE和SEP。根據表3計算得出，RSM模型R2=0.89，RMSE=0.46 g/L，SEP=7.26%，ANN模型R2=0.99，RMSE=0.03 g/L，SEP=0.55%。ANN模型擁有更大R2和更小的RMSE、SEP，模型表現出較好的擬合能力以及預測能力。可能原因是RSM通過二次多項式建立模型，擬合能力不足，不能較好地反映培養基各組分間的非線性關系。而ANN模型是根據現有的實驗數據進行迭代計算，不像RSM模型需要預先給定函數，所以處理非線性問題的能力更強。

2.1.5 GA優化

GA可直接對結構對象進行相關操作，不存在求導和函數連續性的限定，具有全局尋優的優勢。綜合考慮精度、收斂速度以及計算規模等條件，將每代染色體種群設為30，在求出所有染色體適應度后，通過輪盤賭選擇法對種群進行選擇，最大迭代次數為500，采用單點交叉和單點變異，交叉概率為0.5，變異概率為0.08。GA尋優過程見圖3。

圖 3 GA優化過程中最佳適應值和平均適應值的變化過程Fig. 3 Evolution of the best and mean fitness in GA

經過63 次GA優化計算后，GA優化得到的布拉酵母產量最大值為8.28 g/L，并獲得3 種成分最佳組成：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米漿17.32 g/L。最終得到最優培養基配方：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米漿17.32 g/L、硝酸鉀14 g/L、酵母營養鹽1.5 g/L、磷酸二氫鉀0.6 g/L、硫酸鎂0.8 g/L。在該培養條件下，經過3 次重復實驗得到布拉酵母平均產量為8.21 g/L，說明ANN-GA預測具有較好的預測能力。

2.2 發酵罐培養條件的優化結果

在確定的最優搖瓶培養條件基礎上，利用1 L四聯體發酵罐對發酵過程中的溫度、pH值、接種量、溶氧水平等因素進行優化。

由圖4A可知，布拉酵母在發酵第21小時進入穩定期。當培養溫度達到30 ℃時，布拉酵母產量達到最大值，超過30 ℃則有下降的趨勢，可能原因是在30 ℃時布拉酵母內環境較為穩定，新陳代謝所需酶的活性達到較高水平，因此確定30 ℃為布拉酵母最適培養溫度。由圖4B可知，當接種量為6%時布拉酵母生長較為緩慢，當接種量為10%時布拉酵母產量達到最大，當繼續增加接種量，布拉酵母產量則有下降趨勢。因此確定接種量為10%，后續優化在該基礎上進行。

圖 5 pH值（A）及溶氧量（B）對布拉酵母產量的影響Fig. 5 Effect of pH (A) and dissolved oxygen level (B) on dry biomass yield of S. boulardii

由圖5A可知，當發酵過程中pH值為4.0～5.0時，布拉酵母產量呈現出上升的趨勢，pH 5.0時達到16.63 g/L；當培養基初始pH 5.5時，布拉酵母產量降至15.21 g/L，可能原因是在pH 5.0條件下，培養基中各成分的溶解程度較好，細胞能夠很好地利用并進行生長代謝，過高或者過低的pH值環境都不利于該酵母菌的生長，因此確定pH 5.0時為最適值。在布拉酵母發酵過程中，需氧量受菌體濃度、培養基各種成分濃度等多種因素的影響。通過調節空氣流量、罐壓和攪拌速率分別控制溶氧量為30%、35%、40%、45%，由圖5B看出，溶氧量控制在40%（空氣流量控制在0.6～1 L/（L·min），攪拌速率400～600 r/min，罐壓0.05～0.07 MPa）的情況下，發酵水平較為理想。綜上可得，布拉酵母最佳培養條件為溫度30 ℃、接種量10%、恒定pH 5.0、溶氧量40%，在該條件下菌體產量達到19.43 g/L，后續優化在該基礎上進行。

2.3 流加培養方式對布拉酵母發酵的影響

碳源是異養型微生物所需要的重要能量來源，碳源過低會導致營養不足，菌體無法正常生長代謝，而過高的碳源又會影響細胞滲透壓[29]。利用1 L發酵罐研究發酵過程中碳源質量濃度對布拉酵母生長的影響，由圖6A可知，發酵至第8小時葡萄糖基本消耗完畢，通過流加葡萄糖溶液，控制發酵液中糖質量濃度為1、3、5、7 g/L，菌體產量較未流加時分別提高55.94%、89.50%、80.65%和59.55%。當葡萄糖質量濃度增大到5 g/L時，布拉酵母產量呈下降趨勢，可能是由于培養基中糖質量濃度過高對細胞造成滲透壓脅迫。因此確定3 g/L為最適殘糖質量濃度。

圖 6 葡萄糖質量濃度（A）及氨氮質量濃度（B）對布拉酵母產量的影響Fig. 6 Effect of glucose (A) and ammoniacal nitrogen concentration (B)on dry biomass yield of S. boulardii

前期Plackett-Burman試驗表明蛋白胨對布拉酵母發酵培養影響顯著，因此選擇蛋白胨為流加氮源。由圖6B可知，當控制發酵中后期氨氮質量濃度為0.06 g/L時，布拉酵母產量達到最大值（42.36 g/L），較未流加蛋白胨時提高15.05%，因此確定最適氨氮質量濃度為0.06 g/L。

2.4 50 L發酵罐放大培養

由圖7可知，布拉酵母在0～2 h生長緩慢，菌體產量較低，葡萄糖質量濃度由40.52 g/L下降到35.32 g/L。從第2小時開始菌體布拉酵母產量迅速提高，布拉酵母對葡萄糖和氨氮的消耗大幅增加。第8小時時發酵液中葡萄糖基本消耗完畢，通過流加葡萄糖溶液維持殘糖量為3 g/L。發酵至12 h菌體布拉酵母產量為36.25 g/L，此時通過流加蛋白胨溶液維持氨氮質量濃度為0.06 g/L，直到第28小時發酵結束，菌體布拉酵母產量達到51.21 g/L。

圖 7 布拉酵母補料培養生長曲線Fig. 7 Growth curve of S. boulardii in fed-batch fermentation

3 討 論

本實驗對顯著因素進行篩選，并采用CCD，通過構建ANN模型和RSM模型預測培養基的組成。結果表明，在處理該非線性問題時，ANN模型比RSM模型有著更好的擬合和預測能力。陸震鳴等[13]分別采用ANN模型和RSM模型對樟芝發酵建立模型，結果證明，ANN模型的擬合性和預測能力更強，與本實驗所得結論一致。

培養基組成和質量濃度是影響布拉酵母生長的重要因素。本研究在ANN模型的基礎上，通過GA尋優獲得最佳培養基配方，搖瓶培養后菌體產量可達8.21 g/L。雷張藤[9]利用RSM法優化培養基，布拉酵母菌體布拉酵母產量為6.56 g/L。杜曉蒙等[10]通過正交法優化布拉酵母培養基，菌體布拉酵母產量為6.5 g/L，為本實驗結果的79.9%。本研究將有機氮源和無機氮源相結合，能滿足菌體的不同生長階段需求。酵母營養鹽中含有多種離子，玉米漿含有多種生長因子和前體物質，能夠為布拉酵母菌的生長代謝提供豐富的營養[31]。此外在菌種代謝過程中培養基成分之間作用復雜，具有高度的非線性，而傳統優化方法難以解決該問題，本實驗利用ANN模型與GA優化相結合，提高了優化精度。

在布拉酵母的高密度發酵工藝基礎上，流加葡萄糖和蛋白胨控制適宜的葡萄糖和氨氮濃度，培養28 h后布拉酵母產量達到51.21 g/L。雷張藤[9]僅流加單一葡萄糖溶液培養至42 h，菌體布拉酵母產量僅為12.76 g/L，為本實驗結果的75%。由此可見在高密度發酵過程僅流加碳源難以滿足菌體的營養。氮源是構成蛋白質、核酸及其他氮素化合物的重要物質，同時控制適當的碳源和氨氮含量能有效提升布拉酵母產量。