益生菌發酵蘋果漿工藝優化及發酵前后揮發性風味成分分析

任婷婷，岳田利，魏 欣，王 璇，袁亞宏*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

益生菌是一類能在人類及動物腸道內定植和生長，具有抑制致病菌生長能力的有益微生物，具有抑菌、抗癌、提高機體免疫力和預防腹瀉等保健功能[1-3]。大量研究表明，乳酸菌發酵是用于維持和提高果蔬營養、風味、品質、安全和貨架期的最經濟、最有效、最簡單的生物技術方法之一[4-6]。乳酸菌發酵過程中，乳酸菌利用糖類發酵產酸和芳香化合物[7]，發酵后果汁將發酵風味與原果蔬汁的風味相結合，形成乳酸菌發酵果蔬汁獨特的發酵風味[8]。蘋果是我國主要水果產品之一，但多以鮮食為主，加工產量低，且主要為濃縮蘋果汁，加工種類單一，附加值低[9]。蘋果中富含糖類、有機酸、多酚、氨基酸、維生素等營養成分[10]，此外，還含有生物活性物質（如多酚、果膠）[7]，是對人體健康有益的天然抗氧化劑，這使得它成為益生菌發酵的理想基質[11]。

目前，乳酸菌發酵果蔬的基質主要是果蔬清汁，乳酸菌發酵蘋果果漿及其風味物質的研究鮮見報道。蘋果漿中含有淀粉、果膠等大分子物質，乳酸菌不能充分利用，因此需用淀粉酶和果膠酶將果漿中淀粉、果膠等酶解為利于乳酸菌發酵的小分子物質。以蘋果漿為基質經乳酸菌發酵得到的果汁，對比不含果渣的蘋果清汁發酵，果漿發酵溶解了蘋果中全部的營養成分，彌補蘋果清汁發酵過程中微量元素不足的缺點[12]。利用蘋果漿進行發酵，充分利用蘋果果肉資源，更大程度地保留蘋果的原始風味，這不僅提高原料的利用率，而且其營養成分也得到良好的保留和細化[13]，特別是蘋果漿中豐富的維生素、多酚、多糖及多種有機酸等成分，大大提高其營養價值、保健功能及風味特性[12]，而且活菌數也得到一定提高。安興娟等[14]優化植物乳桿菌發酵枸杞胡蘿卜汁工藝條件，但僅以感官評分作為單一評價指標。此外，風味是影響發酵食品品質的重要因素。李海萍等[15]研究乳酸菌發酵果蔬汁前后有機酸、氨基酸、總膳食纖維、B族維生素營養成分的變化，但并未從風味化學的角度進行分析。

本研究利用乳酸菌（植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌）混菌發酵蘋果漿，以發酵后蘋果漿的活菌數和感官評分為綜合評價指標，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優化乳酸菌發酵蘋果漿的工藝條件，旨在開發一種集營養、保健與良好風味于一體的功能型乳酸菌果蔬飲料。通過分析蘋果漿經乳酸菌前后的揮發性風味成分變化，為進一步研究發酵蘋果漿的化學風味提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益生菌菌種：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 21805、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CICC 20250，均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心，保存于西北農林科技大學食品科學與工程學院健康食品制造與安全控制實驗室。

蘋果：紅富士，購于陜西楊凌超市，大小均一，無磕碰、爛果。

MRS肉湯培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂 美國Solarbio公司；氯化鈉（分析純）四川西隴化工有限公司；抗壞血酸 西隴科學股份有限公司；果膠酶 上海源葉生物科技有限公司；中溫淀粉酶 湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司；氫氧化鈉（分析純） 廣東省化學試劑工程技術研究開發中心。

1.2 儀器與設備

HR2096型飛利浦攪拌機 飛利浦電子（香港）有限公司；YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DK-98IIA型電熱恒溫水浴鍋 上海滬粵明科學儀器有限公司；渦旋振蕩器美國Scientific Industries公司；YT-CJ-2ND型超凈工作臺北京亞泰科隆儀器技術有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；ZXSD-A1160型生化培養箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；50/30 μm PDMS/DVB自動固相微萃取進樣器 美國Supelco公司；120150-T230L氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果漿的制備

挑選→清洗→去皮、去核→加蒸餾水和0.15%抗壞血酸→勻漿→果膠酶和淀粉酶酶解→鈍化酶→冷凍待用

1.3.2 蘋果漿發酵

將甘油管保存的乳酸菌接種于MRS液體培養基中，36 ℃靜置培養18 h，活化2 代。用120 g/L NaOH溶液將蘋果漿pH值調為5.9[16]，100 ℃滅菌15 min，置于超凈工作臺上冷卻至室溫。取1 mL經活化后的乳酸菌發酵劑（菌濃度9.0（lg（CFU/mL））），10 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL蘋果漿懸浮乳酸菌。重懸乳酸菌按不同比例及接種量接入蘋果漿中，置于36 ℃靜置發酵48 h后，于4 ℃冷藏24 h[17]。

1.3.3 活菌數的測定

根據GB 4789.35—2010《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行乳酸菌計數。

1.3.4 感官評價[18]

挑選10 名有深厚專業背景的老師及學生，分別對復合乳酸菌發酵蘋果漿進行感官評價，具體評分細則見表1。

表 1 益生菌發酵蘋果漿感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented apple pulp with probiotics

1.3.5 香氣成分富集及測定

根據李維妮等[8]測定方法稍作改進。

采用頂空固相微萃取（head-space solid phase microextraction，HS-SPME）進行香氣成分的富集。用移液槍準確移取5 mL樣品于20 mL進樣瓶中，加入1.5 g氯化鈉，上機測定。進樣瓶先在45 ℃平衡30 min，再用老化過的萃取頭插入進樣瓶中，頂空吸附30 min，然后進行解析測定。

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：DB-17MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；自動進樣，進樣口溫度250 ℃，載氣為He，流速為1.93 mL/min，不分流進樣。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min后以4 ℃/min速率升溫至120 ℃，再以6 ℃/min速率升溫至240 ℃，保持9 min。

1.3.5.2 質譜條件

電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度230 ℃，質量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.5.3 定性定量方法

定性分析：利用氣相色譜-質譜聯用Postrun Analysis分析軟件和NIST14質譜數據庫檢索對比，根據相似度（大于80）和保留時間對各個物質進行分析，確定各色譜峰對應的香氣成分及結構。定量分析：根據色譜圖保留峰面積計算各個香氣成分的相對含量，每個樣品重復3 次取平均值。

1.3.6 單因素試驗

1.3.6.1 料液比對發酵蘋果漿品質的影響

將料液比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1（g/mL）蘋果漿，經100 ℃、15 min滅菌后，按接種量3%，菌種比例植物乳桿菌-嗜酸乳桿菌1∶1（體積比，下同）接種于蘋果漿后，于36 ℃靜置發酵48 h，分別測定其活菌數并進行感官評分。

1.3.6.2 發酵溫度對發酵蘋果漿品質的影響

將料液比2∶1（g/mL）蘋果漿，經100 ℃、15 min滅菌后，按接種量3%，菌種比例植物乳桿菌-嗜酸乳桿菌1∶1接種于蘋果漿后，分別于24、28、32、36、40 ℃靜置發酵48 h，分別測定其活菌數并進行感官評分。

1.3.6.3 接種量對發酵蘋果漿品質的影響

將料液比2∶1（g/mL）蘋果漿，經100 ℃、15 min滅菌后，按接種量1%、2%、3%、4%、5%，菌種比例植物乳桿菌-嗜酸乳桿菌1∶1接種于蘋果漿后，于36 ℃靜置發酵48 h，分別測定其活菌數并進行感官評分。

1.3.6.4 發酵時間對發酵蘋果漿品質的影響

將料液比2∶1（g/mL）蘋果漿，經100 ℃、15 min滅菌后，按接種量3%，菌種比例植物乳桿菌-嗜酸乳桿菌1∶1接種于蘋果漿后，于36 ℃靜置發酵24、36、48、60、72 h，分別測定其活菌數并進行感官評分。

1.3.6.5 菌種比例對發酵蘋果漿品質的影響

將料液比2∶1（g/mL）蘋果漿，經100 ℃、15 min滅菌后，按接種量3%，菌種比例植物乳桿菌-嗜酸乳桿菌4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4接種于蘋果漿后，分別于36 ℃靜置發酵48 h，分別測定其活菌數并進行感官評分。1.3.6.6 滅菌條件對發酵蘋果漿品質的影響[19]

將料液比2∶1（g/mL）蘋果漿，分別經100 ℃、15 min，100 ℃、5 min，90 ℃、15 min，90 ℃、5 min，80 ℃、15 min，80 ℃、5 min滅菌后，按接種量3%，菌種比例按植物乳桿菌-嗜酸乳桿菌1∶1接種于蘋果漿后，分別于36 ℃靜置發酵48 h，分別測定其活菌數并進行感官評分。

1.3.7 復合乳酸菌發酵蘋果汁工藝正交優化試驗

在單因素試驗基礎上，選取發酵溫度、發酵時間、接種量、菌種比例作為自變量，以活菌數和感官評分為評價指標，設計L9（34）正交試驗，采用雙目標優化，因素與水平見表2。

表 2 發酵工藝正交試驗L9（34）設計Table 2 Coded levels and actual levels of independent variables used in orthogonal array design

1.4 數據分析

通過SPSS 16.0軟件，采用聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）研究蘋果漿經乳酸菌發酵前后揮發性風味物質的變化。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對益生菌發酵蘋果漿品質的影響

圖 1 料液比對發酵蘋果漿品質的影響Fig. 1 Effect of apple pulp to water ratio on the quality in fermented apple pulp

由圖1可知，隨著料液比的增大，其活菌數呈遞增的趨勢，料液比為2∶1（g/mL）時，感官評分達到最大值，其風味和組織狀態均很好，料液比為3∶1（g/mL）蘋果漿由于其組織狀態較黏稠，因此乳酸菌發酵蘋果漿的最佳料液比為2∶1（g/mL）。

2.1.2 發酵溫度對益生菌發酵蘋果漿品質的影響

圖 2 發酵溫度對發酵蘋果漿品質的影響Fig. 2 Effect of fermentation temperature on the quality in fermented apple pulp

由圖2可知，隨著溫度的升高，活菌數和感官評分均呈現先上升后下降的趨勢，在發酵溫度32 ℃時，活菌數最高；36 ℃時感官評分最高。綜合判斷正交優化試驗發酵溫度選取32、36、40 ℃。

圖 3 接種量對發酵蘋果漿品質的影響Fig. 3 Effect of inoculum size on the quality of fermented apple pulp

2.1.3 接種量對益生菌發酵蘋果汁品質的影響由圖3可知，隨著接種量的增大，活菌數呈現先上升后下降的趨勢，主要原因是接種量過低，發酵時間較長，而且容易污染雜菌，不僅影響產品的風味同時也會抑制乳酸菌的生長，導致活菌數降低；接種量過高，發酵速度太快，導致微生物細胞易衰老，出現自溶現象，影響發酵蘋果漿的風味[20]。在接種量為3%時，其活菌數達到最大值。接種量為2%時，感官評分達到最大值，綜合判斷正交優化試驗接種量選取2%、3%、4%。

2.1.4 發酵時間對益生菌發酵蘋果漿品質的影響

圖 4 發酵時間對發酵蘋果漿品質的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on the quality of fermented apple pulp

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，活菌數和感官評分均呈現先上升后下降的趨勢。發酵時間過短，發酵力不足，導致發酵后的蘋果漿果蔬味較明顯；發酵時間過長，會產生更多的乳酸，抑制乳酸菌的生長。在發酵時間48 h時，活菌數和感官評分均達到最大值，綜合判斷正交優化試驗發酵時間選取36、48、60 h。

2.1.5 菌種比例對益生菌發酵蘋果漿品質的影響

由圖5可知，隨著植物乳桿菌比例的減小，發酵蘋果漿的活菌數和感官評分均呈先上升后下降的趨勢。當兩者比例為3∶1時，其活菌數達到最大值，而且其感官評分也達到最大值，綜合判斷正交優化試驗發酵菌種比例選取4∶1、3∶1、2∶1。

2.1.6 滅菌條件對益生菌發酵蘋果漿品質的影響

圖 6 滅菌條件對發酵蘋果漿品質的影響Fig. 6 Effect of sterilization conditions on the quality of fermented apple pulp

如圖6所示，隨著滅菌程度的減弱，其活菌數和感官評分均呈下降趨勢，當滅菌條件為90 ℃、15 min，90 ℃、5 min，80 ℃、15 min，80 ℃、5 min時，其風味呈現刺激性的酸臭味，主要是由于殺菌不徹底，雜菌生長，導致發酵失敗造成的。100 ℃、15 min時，其活菌數和感官評分均達到最大值，綜合判斷100 ℃、15 min為最佳滅菌條件。

2.2 復合乳酸菌發酵蘋果漿工藝正交優化試驗

由表3可知，對益生菌發酵蘋果漿活菌數影響因素依次：發酵溫度＞發酵時間＞接種量＞菌種比例。由表4可知，發酵溫度對益生菌發酵蘋果漿的活菌數影響顯著。而對益生菌發酵蘋果漿感官評分影響因素依次：接種量＞菌種比例＞發酵溫度＞發酵時間。方差分析結果表明，乳酸菌接種量和菌種比例對益生菌發酵蘋果漿的感官評分影響顯著。綜合考慮，選擇最優水平為發酵溫度32 ℃、接種量2%、菌種比例4∶1，由于發酵時間對活菌數和感官評分都不具有顯著性，且極差較小，結合正交試驗結果和單因素試驗結果綜合考慮，選擇發酵時間為36 h。在此條件下發酵得到的益生菌發酵蘋果漿活菌數為8.93（lg（CFU/mL）），感官評分為92，口感細膩、組織均勻、酸甜可口，富有濃郁的蘋果芳香及發酵香。

表 3 益生菌發酵蘋果漿的正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal array design with dependent variables

表 4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.3 發酵前后蘋果漿風味變化

從表5可以看出，蘋果漿發酵前有23 種揮發性風味物質，其中醇類3 種、酯類8 種、醛類8 種、酮類1 種等。發酵后的蘋果漿中有12 種風味物質與發酵之前相同，新生成15 種風味物質，以酯類和醇類為主。其中，乙醇被賦予蘋果甜香的風味特征[24-25]，乙酸乙酯被賦予果香和酯香屬性[26]，2-壬酮被賦予香味屬性特征[25]。

醇類物質是微生物通過氨基酸代謝產生的[28]，酯類物質具有水果香[22]，由于酯類物質的風味閾值較低，氣味活度值相比其他物質較高，所以對發酵風味的貢獻較大。酯的生物合成主要是以下兩條途徑：一是酯化，醇類和有機酸在酯酶的作用下生成酯類物質[27]；二是醇解，醇類和甘油酯或乙酰輔酶A在酰基轉移酶或酯酶的作用下合成酯類物質[29]。高濃度的醛類物質會帶來異味[21]，而且醛類物質是不穩定的化合物，特別是在微生物作用下，在食品基質中被還原為醇或被氧化為酸[23]，這可以解釋發酵后的蘋果漿中醛類物質相對含量低而醇類物質相對含量高，分別為5.11%和39.92%。脂肪酸的風味特征是一種不愉快的肥皂味，但它們可以作為酯類物質形成的前體物質[22]。蘋果漿經益生菌發酵后醇類、酮類和酯類風味物質相對增加，醛類風味物質降低，說明酯類、酮類和醇類化合物之間的平衡對于發酵蘋果漿的風味有重要影響。

表 5 發酵前后蘋果漿揮發性風味成分Table 5 Volatile components of apple pulp before and after fermentation

2.4 HCA

HCA是一種無監督模式識別方法，常用于樣品分類，分類前不清楚樣品的分類信息，且不需要輸入其他任何信息[30]。采用HCA以評估發酵前和發酵后果漿中揮發性化合物的變化。通過SPSS 16.0分析軟件，以類間平均距離法作為測量方法，以歐式距離作為度量標準，將發酵蘋果漿和未發酵蘋果漿樣品風味物質聚類成樹狀圖。

圖 7 聚類分析樹狀圖Fig. 7 Cluster analysis dendrogram

由圖7可知，發酵蘋果漿和未發酵蘋果漿樣品分別被準確聚為一類：一種聚類對應于發酵前的蘋果漿樣品（nferm）；另一種聚類對應于發酵后的蘋果漿樣品（ferm）。當歐式距離增大至25.0時，發酵樣品和未發酵樣品才被聚為一類，說明發酵樣品和未發酵樣品之間相似度極低。表明發酵前和發酵后的整體揮發性風味輪廓不同，經益生菌發酵后的蘋果漿風味改變顯著。

3 結 論

以植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌為發酵菌株，建立乳酸菌混菌發酵蘋果漿的最佳工藝條件為發酵溫度32 ℃、發酵時間36 h、接種量2%、菌種比例4∶1、蘋果漿料液比2∶1（g/mL），滅菌條件100 ℃、15 min。在此條件下，發酵得到的益生菌發酵蘋果漿活菌數為8.93（lg（CFU/mL）），感官評分為92。

經氣相色譜-質譜分析檢測，蘋果漿經乳酸菌發酵前后分別檢測出23 種和27 種揮發性風味物質，發酵后新增加15 種風味物質，主要是乙酸乙酯、乙酸丁酯、2-庚酮、2-壬酮、1-己醇等。正是這些新增加的揮發性風味物質之間相互協調與平衡構成乳酸菌發酵蘋果漿的獨特風味。

經HCA表明，發酵蘋果漿和未發酵蘋果漿樣品均被準確分類，蘋果漿經乳酸菌發酵后風味改變顯著。此外，乳酸菌發酵蘋果漿的特征風味物質不僅取決于風味物質的種類和含量，同時還與其風味特征、閾值相關，須通過嗅辨儀結合氣相色譜-質譜以及氣味活度值法綜合分析乳酸菌發酵蘋果漿的特征風味物質。因此，乳酸菌發酵蘋果漿的特征風味物質還有待進一步研究。