耐熱克魯維酵母和粟酒裂殖酵母順序接種發酵對美樂干紅葡萄酒品質的影響

王玉華，盛文軍，李 敏，米 蘭，蔣玉梅，王 婧*

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄與葡萄酒產業技術研發中心，甘肅 蘭州 730070）

近幾年，中國已經成為葡萄酒的消費大國，但對于進口葡萄酒的過度依賴，使我國本土葡萄酒產品面臨嚴峻的市場競爭[1]。目前，與國外優質干紅葡萄酒相比，我國葡萄酒同質化嚴重，各產區、各企業產品的質量層次均一，特點、個性不突出，無法滿足現在消費者對多元化和多樣化的需求[2]。西部作為我國優質葡萄酒產區，其干紅葡萄酒在品質上依然存在色度較淺、顏色穩定性不佳、產地特征不明顯等諸多問題[3]，因此不斷提升我國葡萄酒品質是葡萄酒產業目前亟待解決的問題。

葡萄汁發酵是一個復雜的生物化學過程，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在乙醇發酵中起著決定性作用。然而，近幾年研究發現，一些非釀酒酵母（non-Saccharomyces）對葡萄酒香氣的復雜性和風格的獨特性方面具有積極影響[4-5]。因此利用優選的非釀酒酵母進行多菌種協同發酵，揭示其對干紅葡萄酒品質的影響，對解決葡萄酒產品缺陷和品質提升具有十分重要的意義。

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomce spombe）是一株裂殖屬的非釀酒酵母，具有較高的乙醇發酵能力和蘋果酸轉化能力[5]，其作為非釀酒酵母已經被成功用于朗姆酒和棕櫚酒的發酵生產[6]；國際葡萄與葡萄酒組織已允許其作為生物降酸劑在葡萄酒中使用；已有研究表明[7]，S. pombe可代謝產生含量較高的吡喃型花色苷、甘油和一些特征性香氣物質，因此在葡萄酒發酵方面具有糾正顏色參數、提高香氣復雜性等應用潛力。耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans）是一株能夠代謝產生乳酸的非釀酒酵母，具有增加酒體酸度、降低pH值的能力[8]。有研究指出L. thermotolerans在不同條件下能夠使葡萄酒中乳酸含量從0.23 g/L增加到9.6 g/L，然而L. thermotolerans具有中等乙醇發酵能力，不能單獨完成葡萄汁的乙醇發酵，必須與發酵能力較強的酵母菌共同作用來完成乙醇發酵[9]。Benito等[10]利用L. thermotolerans與S. cerevisiae共同發酵來探索其對西班牙南部葡萄產區的應用效果，其結果表明L. thermotolerans在提高葡萄酒乳酸含量、甘油含量、增加揮發性香氣物質方面有顯著效應。然而，微生物菌種因地域環境的不同和發酵基質的差異其作用結果也有很大差異[11]。目前國內對S. pombe和L. thermotolerans在葡萄酒發酵中的應用研究尚鮮見報道。

本研究以甘肅武威葡萄酒產區美樂葡萄為原料，分別采用S. cerevisiae和S. pombe單獨接種發酵以及L. thermotolerans與S. pombe順序接種發酵的方式釀造美樂干紅葡萄酒，研究其順序接種方式對美樂干紅葡萄酒理化指標、主要香氣物質的種類、含量及風味品質的影響，以期建立一種多菌種發酵工藝模式，為利用非釀酒酵母提升干紅葡萄酒品質提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

美樂葡萄于2016年9月采自甘肅省武威市民勤縣夏博覽葡萄酒莊園，含糖240 g/L（以還原糖計）、可滴定酸7.30 g/L（以酒石酸計）。

1.1.2 菌種與培養基

S. pombe：菌株SP-70購于北京北歐博偉生物技術有限公司（菌種保藏號SP-70）。L. thermotolerans：菌株LTA購于中國工業微生物菌種保藏管理中心（菌種保藏號33099）；菌株LTB購于北京北歐博偉生物技術有限公司（菌種保藏號2.4066）；菌株LTC由安琪酵母公司提供。S. cerevisiae：CECA釀酒酵母活性干粉，安琪酵母公司提供；酒酒球菌（Oenococcus oeni）：OMEGA酒酒球菌活性干粉，購于法國Lallemand公司。

YPD液體培養基（均為質量分數）：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%；YPD固體培養基（均為質量分數）：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，瓊脂2%；賴氨酸培養基購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.1.3 試劑

氯化鈉、醋酸、醋酸鈉、無水碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水葡萄糖、一水合沒食子酸（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；L-蘋果酸、L-乳酸（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；斐林試劑、次甲基藍指示液等按照GB/T 603—2002《化學試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備》配制。

1.2 儀器與設備

160350 D型沸點測定儀 法國Dujardin公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計、TRACE1310-ISQ氣相色譜-質譜聯用儀 法國Salleron公司；TG-WAX氣相色譜柱、Ultimate 3000高效液相色譜儀、BDS HYPERSIL C18液相色譜柱 美國Thermo Scientific公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；500051 S立式高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；PHS-3 C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵實驗

1.3.1.1 菌種培養

將各供試菌株分別接種于YPD液體培養基中，28 ℃培養24 h，再以1%的接種量接種于YPD液體培養基中28 ℃培養24 h，然后進行酵母菌接種實驗。

1.3.1.2 發酵接種方案

將采收的美樂葡萄果實除梗破碎后加入20 mg/L果膠酶，常溫浸漬24 h，取澄清汁并裝入1 L玻璃罐中，裝液量為70%，100 ℃水浴10 min[10]，冷卻后進行接種處理。

接種處理：將擴培的3 株L. thermotolerans菌液以2%接種量分別接種于葡萄汁中（初始菌體數量為106CFU/mL），96 h后分別以2%接種量接入S. pombe菌液進行混合菌種發酵（接種后S. pombe初始菌體數量106CFU/mL）；將擴培的S. pombe菌液以2%接種量接種于葡萄汁中進行單一菌種發酵（初始菌體數量為106CFU/mL）；實驗以S. cerevisiae菌液單一發酵作為對照（初始菌體數量也為106CFU/mL）。接種后于25 ℃控溫發酵；每處理重復3 次。

當殘糖量低于4 g/L時，處理組酒樣中添加60 mg/L的SO2

[12]（以偏重亞硫酸鈉的形式）終止發酵并轉入滅菌的棕色玻璃罐中滿罐陳釀。對照組酒樣乙醇發酵結束后，按0.02 g/L的添加量接入OMEGA酒酒球菌啟動蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fementation，MLF），利用紙層析法檢測蘋果酸減少和乳酸的生成監測發酵進程[13]，當蘋乳發酵結束，則取各發酵試樣檢測理化指標。所有酒樣低溫貯存，陳釀4 個月后對各發酵組取樣檢測香氣成分。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 葡萄酒理化指標測定

總糖、乙醇體積分數、總酸和揮發酸等理化指標參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；色度、色調參照Somers等[14]的方法進行測定。

1.3.2.2 蘋果酸、乳酸分析

參照Buglass[15]和Pérez-Ruiz[16]等方法，并略作修改，采用高效液相色譜儀進行測定。

色譜條件：色譜柱BDS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；二極管陣列檢測器；流動相0.005 mol/L硫酸溶液；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；檢測波長210 nm。

定性：將配好的蘋果酸、乳酸單一標準溶液分別進樣，確定各自的出峰時間，根據保留時間進行定性。定量：將配好不同濃度的蘋果酸和乳酸混合標準液分別進樣，進行定量分析。以不同混合酸標準液的濃度為橫坐標，出峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到蘋果酸、乳酸的標準曲線方程。

樣品測定：取2 mL待測酒樣，加入4 mL水，于10 ℃、8 000 r/min的條件下高速離心10 min。然后取上清液用0.45 μm的無菌濾膜過濾后進樣。根據標準曲線方程分別計算出酒樣中蘋果酸、乳酸的含量。

1.3.2.3 CO2質量損失的測定

參照周麗華等[17]的方法，略作修改。從葡萄汁接入菌種當天開始，每隔24 h對發酵瓶進行稱質量并記錄數據，2 個時間點之間的質量差即為CO2質量損失（即CO2的釋放量）。以CO2質量損失為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制CO2生成曲線。

1.3.2.4 細胞生物量測定

參照Gobbi等[8]的方法，略作修改。單獨接種S. cerevisia和S. pombe的發酵酒樣分別用YPD固體平板進行菌落計數。S. pombe和L. thermotolerans順序發酵的酒樣先用YPD平板進行培養計總數，再用賴氨酸培養基根據形態差異對L. thermotolerans進行計數，差值即為S. pombe的生物量。

1.3.2.5 揮發性化合物測定

取8 mL酒樣于頂空瓶中。加入2.4 g NaCl及10 μL內標物2-辛醇，并加入磁力攪拌轉子，密封并搖勻，然后將樣品放于40 ℃磁力攪拌器中，平衡30 min，插入萃取頭于40 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌吸附富集30 min。

氣相色譜-質譜條件：進樣溫度250 ℃，解吸5 min，不分流進樣，10 min后開啟分流閥；載氣為高純氦氣；流速1 mL/min；程序升溫：初始溫度40 ℃，3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；連接桿和離子源溫度分別為180 ℃和200 ℃；掃描范圍m/z 50～350。

定性：香氣成分利用MS全離子掃描模式下的總離子流圖譜，依據色譜保留時間和質譜信息、NIST08標準譜庫比對結果以及參考相關文獻相結合的方法進行定性分析。定量：采用內標法進行定量分析。

1.3.3 感官分析

選擇10 名經過專業培訓的甘肅農業大學葡萄酒專業的老師及研究生（6 名女性和4 名男性）對所釀葡萄酒進行感官評定。感官評價的場所在本學院的品酒室進行。供品嘗酒樣在14 ℃下貯存，以隨機順序提供給品嘗者。品鑒從視覺（顏色強度、色調）、香氣（香氣強度、花香、果香、異味）和風味（甜味、酸味、酒體、余味長短）共10 個屬性方面進行，用8 分結構化數值進行量化，0～8 分表示感官逐漸增強。

1.4 數據分析

采用Excel 2010 進行數據處理，SPSS 22.0對數據進行單因素方差分析，利用Duncan多重比較在置信區間0.05下對數據進行差異顯著性分析，對不同處理酒樣的香氣化合物進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 基本理化指標

表 1 供試酒樣乙醇發酵結束時理化指標Table 1 Physicochemical indices of wine samples at the end of alcoholic fermentation

從表1可以看出，各處理組總糖質量濃度均小于4 g/L。S. pombe單獨接種發酵的酒樣與對照酒樣相比，其乙醇體積分數無顯著差異，而L. thermotolerans與S. pombe順序接種發酵的3 個處理組與對照組相比其乙醇體積分數顯著降低，這一結果說明L. thermotolerans與S. pombe順序接種在乙醇發酵能力方面低于S. cerevisiae單獨接種發酵。揮發酸含量是判斷葡萄酒健康狀態或腐敗情況的指標[18]，同時根據GB/T 15037—2006要求揮發酸不能高于1.0 g/L，順序接種的3 個處理組與對照組相比揮發酸含量均低于國標要求，相比揮發酸質量濃度顯著降低了0.11～0.16 g/L。另外，用S. pombe單獨接種的酒樣總酸質量濃度顯著低于對照組酒樣，而順序接種的3 個處理組總酸含量與對照組相比增加了0.96～1.97 g/L。pH值的高低與總酸結果相對應，順序發酵使pH值顯著降低0.45～0.59。關于顏色指標方面，用S. pombe單獨接種發酵的酒樣色度值最高，有S. pombe參與的3 組順序接種酒樣的色度值也顯著高于對照組。S. pombe參與發酵的處理酒樣與對照組酒樣的色調值相比顯著降低，說明處理組酒樣比對照組更能呈紅色色調。

2.2 蘋果酸、乳酸含量分析

圖 1 供試酒樣蘋果酸、乳酸生成量Fig. 1 Production of malic acid and lactic acid of sample wines

單獨接種S. cerevisiae的對照組在MLF后進行蘋果酸、乳酸含量測定，其他處理組的酒樣于乙醇發酵結束后進行蘋果酸、乳酸含量測定。由圖1可知，S. pombe單獨發酵和順序發酵的酒樣中蘋果酸含量與接入乳酸菌進行蘋乳發酵的對照組相比無顯著差異。3 組順序接種處理組酒樣中乳酸質量濃度差異不顯著（2.46～2.86 g/L），但均顯著高于對照組（P＜0.05），順序發酵酒樣在不進行MLF的情況下，減弱了口感尖銳的蘋果酸增加了口感柔和的乳酸，表明L. thermotolerans與S. pombe順序接種發酵具有代替蘋果酸-乳酸發酵的潛在可能性。

2.3 CO2質量損失分析

在葡萄汁乙醇發酵過程中CO2質量損失可代表菌株的發酵力，CO2質量損失速率可作為菌株的乙醇發酵速率[17]。由圖2可知，對照組在第8天完成乙醇發酵，單獨接種S. pombe酒樣在第16天完成乙醇發酵，兩菌株CO2總質量損失相似，說明S. pombe與S. cerevisiae菌株具有相似的發酵能力，但發酵速度較為緩慢。順序接種的3 組處理酒樣在接入L. thermotolerans菌株24 h內均能啟動發酵，當第4天接入S. pombe后，發酵速率提升，于第12天后發酵速率逐漸緩慢，最終在第16天時CO2釋放基本停止完成發酵。

圖 2 供試酒樣CO2質量損失Fig. 2 CO2 production of sample wines

2.4 生物量分析

圖3A為單獨接種S. cerevisiae和S. pombe的酒樣中其菌體數量的變化情況，至乙醇發酵結束，S. pombe和S. cerevisiae的生長動態基本相似，最初菌體數量增長快速，隨后略有下降，從發酵第6天到乙醇發酵結束的第16天，其菌體數量均穩定在106CFU/mL。3 組順序接種發酵過程中各處理酒樣中兩種非釀酒酵母生長動態見圖3B～D。3 株L. thermotolerans在順序接種發酵過程中其菌體生長趨勢相似，自接種之后的2 d內，菌體數量快速增加，在2～4 d內菌體數量達到最大，當接入S. pombe后的第2天，L. thermotolerans菌體數量開始迅速減少并逐漸消失，菌株LTA（圖3B）在第10天全部消亡，菌株LTB（圖3C）和菌株LTC（圖3D）均在第12天時無法檢測到其活細胞存在，而S. pombe在第16天乙醇發酵結束時菌體數量依然保持在105CFU/mL。

圖 3 供試酒樣生物量Fig. 3 Yeast population during wine fermentation

2.5 揮發性香氣化合物分析

葡萄酒的釀造過程是一個復雜的生物化學反應，其香氣復雜多變，主要來源有葡萄品種，酵母發酵與陳釀過程。實驗所得酒樣中共檢測出77 種香氣化合物，包括26 種酯類（約占香氣總量的27.89%），16 種醇類（約占香氣總量的54.64%），15 種有機酸（約占香氣總量的15.53%），12 種萜烯類（約占香氣總量的0.90%），7 種其他類化合物（約占香氣總量的1.03%）。與僅用S. cerevisiae發酵的對照組先比，順序接種處理組的酯類、醇類和酸類的含量分別下降了38.46%～49.34%、13.36%～19.42%、46.84%～49.71%，種類相差不大。而萜烯類和其他類化合物在種類和含量上均有所增加，其含量要比對照組增加32.47%～42.65%。

表 2 供試酒樣香氣成分及含量Table 2 Concentrations of aroma components in wines

續表2

續表2

2.5.1 酯類化合物

酯類物質主要通過酵母代謝以及酒中的酯化反應產生，通常賦予葡萄酒一定的花香、果香[28]。由表2可以看出，本實驗中各發酵酒樣所檢測到酯類物質共26種，其酯類化合物總量有所不同。L. thermotolerans和S. pombe順序發酵的酒樣酯類化合物質量濃度在2 310.63～2 807.09 μg/L，與單獨用S. cerevisiae接種發酵4 561.44 μg/L相比降低了38.46%～49.34%，單獨用S. pombe接種的酒樣酯類總量為2 561.11 μg/L，與3 組順序發酵酒樣含量接近。在3 組順序發酵酒樣中貢獻較大的物質有正己酸乙酯（550.20～569.42 μg/L）、辛酸乙酯（613.05～643.00 μg/L）和癸酸乙酯（477.88～828.85 μg/L），雖然其含量均低于對照組，但均超過相應閾值，對葡萄酒果味香氣有積極貢獻。

2.5.2 高級醇類化合物

葡萄酒中高級醇類物質主要通過酵母發酵過程中糖代謝和氨基酸轉化而成[29]。有研究顯示當高級醇質量濃度小于300 mg/L時，對于葡萄酒的感官品質具有積極作用[30]。本實驗中各發酵酒樣檢測到的高級醇類物質總量由高到低排列順序為S. cerevisiae純種發酵酒樣（7 241.44 μg/L）、L. thermotolerans和S. pombe順序發酵酒樣（5 834.91～6 274.28 μg/L）、S. pombe純種發酵酒樣（3 545.40 μg/L）。其中，單獨用S. pombe接種試樣中高級醇含量與對照S. cerevisiae相比顯著下降，順序接種酒樣與對照相比也下降了13.36%～19.42%。說明S. pombe參與發酵的試樣，高級醇總量均有所下降[31]。各供試酒樣個別物質含量也存在差異，3 組順序發酵的處理組苯乙醇含量較對照組高，且超過感官閾值，為葡萄酒提供玫瑰等花粉香氣。

2.5.3 酸類化合物

酸類化合物是酵母發酵過程中代謝的副產物，主要在乙醇發酵和蘋乳發酵過程中產生，葡萄酒中通常表現出來的奶酪味以及脂肪味與葡萄酒中存在的酸類化合物密切相關[32-33]。由表2可知，各發酵試樣酸類化合物種類相差不多，用S. cerevisiae單獨接種發酵的酒樣酸類化合物質量濃度（2 637.04 μg/L）高于順序發酵酒樣（1 326.21～1 401.81 μg/L）。順序發酵酒樣與對照相比酸類化合物含量降低了46.84%～49.71%，各發酵酒樣中單個有機酸類物質在含量上存在一定差異，但排在前三位的有機酸類物質相同，分別為辛酸、癸酸、己酸。

2.5.4 萜烯類化合物

萜烯類化合物來源于葡萄果實本身，主要以糖苷鍵合態形式存在，釀造過程中可在糖苷酶作用下轉變為揮發性的游離態香氣化合物，從而賦予葡萄酒品種香氣特征[34]。本實驗處理組中所檢測到的萜烯類物質的種類和含量均高于對照組，對照組中僅檢測到橙花醇和葉醇。單獨接種S. pombe的酒樣中萜烯類物質總量達到120.55 μg/L，L. thermotolerans和S. pombe順序接種的酒樣中萜烯類物質質量濃度范圍在83.47～126.03 μg/L。其中，對順序發酵酒樣起到主要貢獻作用的物質有芳樟醇（薰衣草香）和香茅醇（檸檬、柑橘香），這些物質含量均超過感官閾值，賦予葡萄酒花果香氣，提高了葡萄酒香氣的復雜性。

2.5.5 其他類化合物

本實驗酒樣中還檢測到了癸醛、仲辛酮、大馬酮、枯烯、苯乙烯、2,6-二叔丁基對甲酚、2,4-二叔丁基對甲酚7 種物質，這些物質對于酒體的平衡具有一定的貢獻，其質量濃度由高到低排序為順序發酵酒樣（124.82～130.11 μg/L）、S.cerevisiae純種發酵酒樣（85.50 μg/L）、S. pombe純種發酵酒樣（69.63 μg/L）。在非釀酒酵母參與發酵的酒樣中均有大馬酮（蘋果、蜂蜜、玫瑰香）和2,6-二叔丁基對甲酚（藥味、煙味、酚醛味）的檢出，但順序發酵的酒樣大馬酮的含量高于S. pombe純種發酵的試樣，而2,6-二叔丁基對甲酚的含量在非釀酒酵母酒樣中含量相差不大。

2.6 各處理酒樣揮發性香氣的主成分分析

將供試酒樣進行主成分分析，以特征值大于1為依據，提取4 個公因子，其中PC1、PC2和PC3的累計方差貢獻率為86.20%。由圖4可知，PC1、PC2、PC3的方差貢獻率分別為51.05%、20.41%和14.74%。可以看出，與PC1高度正相關的是一些具有濃郁花果香的酯類、醇類（如乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯和卞醇）以及某些具有消極氣味的酸類（如辛酸、癸酸等），而1-壬醇和2,6-二丁基對甲酚與PC1呈負相關（載荷系數大于0.9）。PC2主要體現了乙酸苯乙酯、苯乙醇、3-乙氧基丙醇等香氣化合物的重要信息（載荷系數大于0.7），與檢測到的大多數萜烯類物質呈負相關。對PC3起主要貢獻作用的物質有2,3-丁二醇、2,4-二丁基對苯酚等（正相關），與丁二酸單乙酯、仲辛酮呈負相關。

圖 4 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Fig. 4 PCA loading plots of volatile aroma compounds

圖 5 不同酒樣主成分分析得分圖Fig. 5 PCA score plots of wines

由圖5可知，所有供試酒樣可聚為3 類。純種S. cerevisiae發酵的對照組聚為一類，PC1得分最高。兩株非釀酒酵母順序接種的3 個處理組距離較近，可聚為一類，且PC2得分相對較高，主體香氣化合物為乙酸苯乙酯、苯乙醇等物質，賦予葡萄酒濃郁的花果香氣。純種S. pombe發酵可單獨聚為一類，位于PC3的正半軸，主要與一些具有消極氣味的物質（如2,3-丁二醇、2,4-二丁基對苯酚）相關。

2.7 感官分析

圖 6 感官分析雷達圖Fig. 6 Rader map of sensory analysis

通過對所有酒樣的感官分析（圖6）可知，各發酵試樣在酒體和余味長短方面得分無顯著差異。在顏色方面，S. pombe單獨發酵的酒樣顏色強度獲得最高分數，有S. pombe參與的順序發酵試樣得分也高于用S. cerevisiae純種發酵的酒樣，與圖3結論相一致。對香氣分析說明，3 株L. thermotolerans與S. pombe順序接種發酵的酒樣花香味突出明顯，但與對照相比有稍微明顯的生青味。另外，順序接種發酵有較高的酸度和甜度。綜上所述，3 組順序接種發酵酒樣相對于傳統的釀酒方式顏色外觀有所提升，酸度增加，花香較突出。另外，3 組順序發酵酒樣感官品質分析得分無太大差異。

3 討 論

L. thermotolerans和S. pombe菌株順序培養發酵產生乳酸，這取決于L. thermotolerans菌株的生長程度，因此本研究以間隔4 d的順序接種模式，目的是確保在添加S. pombe前，L. thermotolerans的生長數量達到最大。Kapsopoulou等[35]證實L. thermotolerans菌株在體積分數9%乙醇環境中只能夠存活數天，其乳酸生成曲線與其生長曲線一致，當細胞數量達到最大，乳酸生產量也達到最大，這也支持了本實驗的結果，L. thermotolerans在發酵第4天菌體數量達到最大，當接入S. pombe菌液后，L. thermotolerans菌體數量開始迅速減少，在兩種菌體混合發酵的過程中，L. thermotolerans能夠存活的時間不超過12 d。也有研究顯示[9-10]，不同的L. thermotolerans菌株及不同發酵條件，乳酸產量差異較大（0.23～9.6 g/L），本實驗中L. thermotolerans菌株LTA最多能夠產生的乳酸為2.86 g/L，供試的3 種菌株之間對乳酸的產生量差異不大。L. thermotolerans和S. pombe順序接種釀造的美樂干紅葡萄酒降低了揮發酸和乙醇體積分數，但需要更長的時間完成發酵，這與Del-Fresno等[9]的研究結果一致，由于S. pombe具有將蘋果酸轉化為乙醇[5]的能力，順序發酵酒樣可在不添加酒酒球菌的情況下降解尖銳的蘋果酸增加口感柔和的乳酸。Benito等[36]的研究也表明L. thermotolerans和S. pombe混合發酵具有代替MLF的潛能。本研究處理酒樣中色度值顯著增加，色調值顯著下降，這主要是由于S. pombe菌株參與發酵的結果。vitisin A是葡萄酒中主要的吡喃型花色苷，在葡萄酒釀造過程中，丙酮酸可將花色苷吡喃環上的第4個C原子和與其相連的苯環第5個C原子連成六元的含氧雜環，形成vitisin A[37]。S. pombe在葡萄汁發酵過程中可產生大量的丙酮酸，使vitisin A產量增加從而改善顏色參數[38]。其次，S. pombe的羥基肉桂酸乙酯脫羧酶活性高于釀酒酵母，該酶能夠促進羥基肉桂酸脫羧形成乙烯基苯酚，并與葡萄花色素縮合形成顏色穩定的苯乙烯基吡喃花色苷加合物[38]。對于揮發性化合物，L. thermotolerans和S. pombe菌株順序發酵酒樣中酯類、高級醇類和酸類化合物的含量都有所下降，Morales等[39]對L. thermotolerans和S. cerevisiae混合發酵酒樣的揮發性化合物進行定期監控，發現混合發酵酒樣的酯類、高級醇類和酸類化合物的含量均不及單獨用S. cerevisiae發酵的葡萄酒。其中，高級醇類含量的下降主要與S. pombe菌株相關，Loira等[31]指出有S. pombe參與的混合發酵，高級醇含量均有所下降。本實驗還得出順序發酵酒樣的苯乙醇含量有所增加，Gobbi等[8]在L. thermotolerans和S. cerevisiae混合發酵的酒樣中也得到相同結論。

傳統葡萄酒釀造通常選擇S. cerevisiae作為單一的發酵劑，本實驗將L. thermotolerans和S. pombe兩種非釀酒酵母順序接種釀造美樂干紅葡萄酒打破了傳統的釀酒模式，提高了干紅葡萄酒的感官品質。但此實驗僅為相關菌種的基礎研究，對于其在酒廠中的實際應用及基因方面的研究仍需進一步探索。目前，國內對于非釀酒酵母改善葡萄酒品質的研究還鮮有報道，因此，開發出更多具有特色的非釀酒酵母勢在必行。

4 結 論

L. thermotolerans和S. pombe以間隔4 d順序接種發酵過程中，L. thermotolerans菌體前期數量增長迅速，第4天菌體數量達到最大，但在接入S. pombe的第2天，菌體數量明顯減少，并在10～12 d完全消亡。3 株L. thermotolerans和S. pombe菌株以順序接種方式發酵產生的乳酸含量無顯著差異，其質量濃度為2.46～2.86 g/L。發酵的美樂干紅葡萄酒其基本理化指標符合國標要求，順序接種發酵能夠使揮發酸降低0.11～0.16 g/L，總酸增加0.96～1.97 g/L，也能夠增加酒體色度，降低酒體色調。順序接種發酵酒樣中酯類、高級醇類和有機酸類化合物的含量分別下降了38.46%～49.34%、13.36%～19.42%、46.84%～49.71%，但增加了苯乙醇、萜烯類和大馬士酮等揮發性化合物的產出，提高了香氣的復雜性。感官分析表明順序發酵改善了葡萄酒的色澤，酸度偏高，花果香氣明顯。表明L. thermotolerans菌株與S. pombe菌株以間隔4 d的順序接種方式發酵具有替代蘋果酸-乳酸發酵的潛力，對葡萄酒增酸和感官品質的提升也具有積極影響。