HPLC法同時測定不同生長年限不同部位杜仲中5 種苯丙素類成分

張子東，付冬梅，張威鵬，張 琳,*，祖元剛

（1.東北林業大學 森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學

教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）為杜仲科杜仲屬植物，現已收入我國藥食同源管理系統，已被世界許多國家引用栽培，供保健、藥用和觀賞[1]。《神農本草經》《本草綱目》《本草經集注》等典籍中就記載了杜仲的保健功能。傳統上以杜仲皮為保健原料，由于當杜仲的生長年限到達20 a左右，其杜仲皮才更具有保健功效[2]，而杜仲剝皮會導致樹木死亡[3]，嚴重破壞我國二級保護植物杜仲資源。為解決當前杜仲樹皮資源問題，急需探索杜仲其他藥用部位中的相似活性成分。近期報道發現，杜仲葉中富含的苯丙素類成分具有廣泛的降壓、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、強筋健骨、增加胃腸蠕動和促進胃液分泌的藥理作用[4-6]。目前針對杜仲中木脂素類、黃酮類活性成分的檢測分析方法較多[7-11]，而針對杜仲中苯丙素類成分的研究相對較少[12]。苯丙素作為杜仲中主要活性成分，不同藥用部位含量不同，具有一定的開發價值[13-14]。有研究報道稱杜仲葉中的綠原酸含量遠高于杜仲干皮[15-16]，但鮮見對不同生長年限的杜仲葉、干皮中一系列苯丙素類成分的含量進行比較研究。因此，本實驗建立同時測定杜仲中的綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 種苯丙素類活性成分的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，分別測定樹齡為16、18、20、22、24 a的杜仲葉與杜仲干皮2 種部位中綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 種苯丙素類成分含量，為藥食同源植物的質量控制指標提供依據，并為其開發研究提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生長年限分別為16、18、20、22、24 a的杜仲葉、杜仲干皮樣品來自陜西省漢中市略陽縣國家杜仲良種基地。

標準品：紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸（純度＞98%）中國藥品生物制品檢定所；原兒茶酸（純度＞98%）大連美侖生物技術有限公司；松柏苷（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；實驗用水為去離子水；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20A HPLC儀（包括SPD-20A紫外檢測器）日本島津公司；KQ2200D型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DFT-50手提式高速萬能粉碎機溫嶺市林大機械有限公司；Unique-LC R20多功能超純水系統 廈門銳思捷水純化技術有限公司；D3024R高速冷凍離心機 大龍興創實驗儀器有限公司；BS124S型分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助法提取苯丙素類成分的單因素試驗

因綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 種苯丙素類活性成分極性較大，通常可選擇甲醇、乙醇或水進行提取，為將苯丙素類成分提取全面，選擇極性相對較大的甲醇作為提取溶劑。分別對甲醇體積分數、超聲提取時間、料液比進行單因素試驗，考察各因素對杜仲中苯丙素類成分含量提取率的影響[17-19]。

1.3.1.1 甲醇體積分數對杜仲樣品中苯丙素類成分提取率的影響

分別精密稱取4 份杜仲樣品20 g，分別加入體積分數25%、50%、75%、100%甲醇溶液，料液比為1∶10（g/mL），超聲提取30 min，以杜仲中苯丙素類成分提取率之和為考察指標，考察甲醇體積分數對杜仲中苯丙素類成分提取率的影響。

1.3.1.2 超聲提取時間對杜仲樣品中苯丙素類成分提取率的影響

分別精密稱取4 份杜仲樣品20 g，加入體積分數100%甲醇溶液，料液比為1∶10（g/mL），超聲提取15、30、45、60 min，以杜仲中苯丙素類成分提取率之和為考察指標，考察超聲提取時間對杜仲中苯丙素類成分提取率的影響。

1.3.1.3 料液比對杜仲樣品中苯丙素類成分提取率的影響

分別精密稱取4 份杜仲樣品20 g，加入體積分數100%甲醇溶液，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL），超聲提取30 min，以杜仲中苯丙素類成分提取率之和為考察指標，考察料液比對杜仲中苯丙素類成分提取率的影響。

1.3.2 苯丙素類成分HPLC測定

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：HiQ Sil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.2%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～12 min，4%～12% B；12～35 min，12%～14% B；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長277 nm；進樣量5 μL。

1.3.2.2 混合標準品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷標準品適量，用無水甲醇溶解，配制成1 mg/mL的混合標準品溶液。

1.3.2.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取粉碎后的杜仲葉、杜仲干皮粉末1.0 g，加入10 mL無水甲醇超聲提取30 min，過濾，保留濾液。濾渣再次加入10 mL無水甲醇超聲提取30 min，過濾，合并濾液，混勻。分別從各合并濾液中吸取1 mL，12 000 r/min離心10 min，取上清液即得。

1.3.2.4 方法學考察

1.4 統計分析

用R studio軟件Tidyverse包，對所得數據進行可視化處理及統計分析。

2 結果與分析

2.1 測定成分選擇結果

苯丙素類是廣泛存在于藥用植物中的天然產物，具有非常豐富的生理活性，尤其具有降壓、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理活性[22]。杜仲中苯丙素類成分功能已經成為天然降壓、抗炎保健食品的重要來源[23]，現已成為眾多植物學家，藥物化學家的重點研究對象。綠原酸、咖啡酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷為杜仲中苯丙素類代表性成分，并且這5 種成分也是其他某些藥用植物的質量控制標準。其中綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸的降壓、抗菌抗炎活性機制已有大量研究報道[24-28]。因此本實驗選擇以上5種苯丙素類成分為測量指標，研究不同生長年限杜仲葉、杜仲干皮中苯丙素類成分含量，為杜仲的開發研究提供一定的參考價值。根據大部分研究報道可知，建立測定杜仲中綠原酸含量的HPLC方法相對較多，針對性建立測量杜仲中一系列苯丙素類成分的HPLC方法卻很罕見，本實驗的檢測方法對于富含這5 種苯丙素類成分的天然藥物質量評價、含量分析具有一定的參考價值。

線性關系：取1.3.2.2節原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸的混合標準品溶液，精密梯度稀釋成質量濃度分別為1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 mg/mL的含有5 種苯丙素類成分的混合標準品溶液，在1.3.2.1節色譜條件下進樣，進樣量為5 μL，以標準品質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，色譜峰峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。

精密度：將1.3.2.2節混合標準品溶液梯度稀釋成低、中、高3 種不同質量濃度（0.01、0.1、1 mg/mL）的供試品溶液，并連續進樣5 次，每次5 μL，按1.3.2.1節HPLC條件測定峰面積，分別計算各成分峰面積的相對標準偏差。

穩定性：取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h進樣5 μL，按1.3.2.1節HPLC條件測定峰面積，分別計算各成分峰面積的相對標準偏差。

重復性：分別稱取杜仲葉、干皮粉末各5 份，按1.3.2.3節方法制備供試品溶液（n=3），按1.3.2.1節HPLC條件測定峰面積，計算各成分峰面積相對標準偏差。

加標回收率：稱取已知含量的杜仲葉粉末適量，共6 份，按1.3.2.3節方法平行制備供試品溶液，精密稱取10 mL供試品溶液，分別適量加入1.3.2.2節混合標準品溶液，按1.3.2.1節HPLC條件進樣測定，計算原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸的加標回收率與相對標準偏差[20-21]。

1.3.2.5 樣品測定

將經過1.3.2.3節方法處理的各供試品溶液應用1.3.2.1節色譜條件進行HPLC測定，進樣量為5 μL，應用外標法測定含量。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 甲醇體積分數的影響

圖 1 甲醇體積分數對苯丙素類成分提取率的影響Fig. 1 Effect of MeOH concentration on the yield of phenylpropanoids

由圖1可知，甲醇體積分數對杜仲中苯丙素類成分提取率影響較大，隨甲醇體積分數的增加，苯丙素類成分提取率隨之增加，且在甲醇體積分數為100%時，苯丙素類成分提取率最大。所以選擇100%甲醇溶液作為提取溶液。

2.2.2 超聲提取時間的影響

由圖2可知，超聲提取時間對杜仲中苯丙素類成分提取率影響較大，隨超聲提取時間的延長，苯丙素類成分提取率隨之增加，且在超聲提取時間為30 min時，苯丙素類成分提取率最大，可得最佳超聲提取時間為30 min。

圖 2 超聲提取時間對苯丙素類成分提取率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of phenylpropanoids

2.2.3 料液比的影響

圖 3 料液比對苯丙素類成分提取率的影響Fig. 3 Effect of solid to solvent ratio on the yield of phenylpropanoids

由圖3可知，隨著溶劑量的增加，苯丙素類成分提取率呈增加趨勢。當料液比為1∶10（g/mL）時，提取率達到最大值，當溶劑量繼續增加時提取率呈下降趨勢，可得最佳料液比為1∶10（g/mL）。

2.3 苯丙素類成分HPLC測定

2.3.1 色譜條件選擇結果

本實驗通過借鑒測定杜仲中綠原酸含量HPLC方法[29-30]，建立1.3.2.1節色譜條件。實驗過程中發現選擇甲醇為流動相時，5 種成分的色譜峰出現堆積現象，于是選擇極性更大的乙腈作為流動相。在流動相A的選擇上，實驗初期存在峰后拖現象，于是將流動相A在0.1%甲酸的基礎上改為0.2%甲酸后，峰拖尾現象明顯改善。實驗結果表明，在最終HPLC條件下各色譜峰分離效果最佳。

2.3.2 HPLC分析

如圖4所示，杜仲葉、干皮樣品中5 種苯丙素成分分離度良好，基線平穩，出峰完全且峰形規范。

圖 4 混合標準品（A）、杜仲葉樣品（B）、杜仲干皮樣品（C）的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of standard mixture (A), E. ulmoides Oliv. leaves (B), and barks (C)

2.3.3 方法學考察結果

2.3.3.1 線性關系

由表1可知，各苯丙素類成分在各自線性范圍內線性關系良好。

表 1 5 種成分的線性關系Table 1 Linear relationships of five phenylpropanoids

2.3.3.2 精密度

結果顯示，低質量濃度組中綠原酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面積相對標準偏差分別為0.89%、1.43%、2.87%、2.09%、4.15%；中質量濃度組中綠原酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面積相對標準偏差分別為1.76%、2.88%、1.09%、3.25%、2.87%；高質量濃度組中綠原酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面積相對標準偏差分別為4.31%、0.98%、2.87%、1.23%、3.28%，表明分析方法的精密度良好。

2.3.3.3 穩定性

結果顯示綠原酸、松柏苷、原兒茶酸、紫丁香苷、咖啡酸峰面積相對標準偏差分別為0.78%、1.55%、0.99%、2.35%、0.98%，說明樣品在24 h內穩定。

2.3.3.4 重復性

結果顯示，原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸峰面積相對標準偏差分別為0.53%、0.97%、1.12%、1.44%、0.67%。表明該方法重復性較好。

2.3.3.5 加標回收率

根據1.3.2.4節方法學考察中加標回收率考察方法，計算原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸的加標回收率與相對標準偏差，結果如表2所示，此方法具有較好的檢測性能。

表 2 回收率實驗結果Table 2 Results of recovery tests

2.4 杜仲中苯丙素類成分含量測定結果

取樹齡為16、18、20、22、24 a的杜仲葉、杜仲干皮樣品，按1.3.2.3節方法分別制備供試品溶液，后采用1.3.2.1節HPLC條件進行測定（n=3），取平均值后，根據2.3.3.1節各成分的標準曲線計算5 種苯丙素類成分的含量，如表3所示。

表 3 不同生長年限杜仲葉、干皮5 種苯丙素類成分測定結果Table 3 Contents of 5 phenylpropanoids in E. ulmoides Oliv. leaves and barks in various growing yearsμg/g

為使各樣品中5 種苯丙素類成分含量數據更便于比較，使用R語言Tidyverse包將表3中數據進行可視化處理。由于不同藥用部位杜仲樣品中的苯丙素類成分含量差距巨大，于是將所有含量結果進行取對數（lg）運算，如圖5所示。

圖 5 杜仲樣品中5 種苯丙素類活性成分含量的環狀柱形圖Fig. 5 Circular barplot of contents of 5 phenyl compounds in E. ulmoides Oliv. samples

研究表明，杜仲葉、干皮中均含有這5 種苯丙素類化合物，但其含有量差別較大。由圖5可知，綠原酸在杜仲葉與杜仲干皮中含量差異尤為明顯（P＜0.01），杜仲葉中的綠原酸含量平均約為杜仲干皮中的57 倍；杜仲葉中松柏苷、紫丁香苷含量約為杜仲干皮的1.24、9.19 倍；咖啡酸、原兒茶酸在杜仲葉、干皮中含量均較低，且含量差距不大，咖啡酸在杜仲葉中含量約為干皮的2.4 倍，而杜仲干皮中的原兒茶酸含量大部分要高于杜仲葉。杜仲葉中的多數苯丙素類成分含量存在遠高于杜仲干皮的現象。因為各生長年限的杜仲葉、杜仲干皮中均含有這5 類具有降壓、抗炎作用的苯丙素類活性成分，且杜仲葉中的5 種苯丙素類活性成分總量高于杜仲干皮，所以在抗炎殺菌、降壓藥物使用上，可以考慮使用杜仲葉代替杜仲干皮。

3 結 論

以HPLC法同時測定杜仲中綠源酸、咖啡酸、原兒茶酸、松柏苷、紫丁香苷5 種苯丙素類成分含量，建立HPLC含量測定方法，此分析方法精密度、穩定性、重復性好，可作為杜仲中5 種苯丙素類成分的檢測方法，為杜仲的綜合利用和深度開發提供質量控制參考依據。由于各生長年限的杜仲葉與杜仲干皮中均含有這5 類活性成分，且杜仲葉與杜仲干皮中的成分含量存在明顯不同，這在將杜仲應用于抗炎殺菌、降壓、強筋健骨保健品的開發上應當注意。因為杜仲葉中苯丙素類成分含量較高，且杜仲葉為可再生資源，所以可進一步考慮有關杜仲葉的研究與開發。