L-阿拉伯糖與氨基酸美拉德反應揮發性風味物質分析

馮 濤，趙 宇，張治文，莊海寧，宋詩清，姚凌云，孫 敏，徐志民

（1.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.上海市農業科學院食用菌研究所，上海 201403；3.美國路易斯安那州立大學食品科學系，美國 路易斯安那 巴吞魯日 70802）

美拉德反應由法國著名化學家Maillard L C于1912年發現并命名[1]，是廣泛存在于食品工業的一種非酶褐變，又稱為“非酶棕色化反應”。該反應是羰基化合物和氨基化合物經過復雜的歷程最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質類黑精或稱擬黑素，故又稱其為羰氨反應[2-3]。

L-阿拉伯糖是一種低熱量甜味劑，可抑制腸道內蔗糖酶的活性，減少蔗糖吸收，有效減少體內糖含量[4]。此外，L-阿拉伯糖還可抑制脂肪堆積，用于防治肥胖、高血壓、高血脂等疾病[5-6]。日本厚生省將L-阿拉伯糖列入“調節血糖的專用特殊保健食品添加劑”；美國醫療協會將L-阿拉伯糖列入“抗肥胖的營養補充劑或非處方藥”；2008年我國衛生部正式批準L-阿拉伯糖為新資源食品，確認其在功能糖領域的重要地位[7]。

近年來研究發現L-阿拉伯糖的反應型香精香氣柔和、豐富，賦予使用香精終端產品以更接近自然和飽滿的香氣，許多國際香精公司開始研究使用L-阿拉伯糖生產反應型香精，如美國Danisco公司已有L-阿拉伯糖CT98和L-阿拉伯糖糖漿2 種產品作為反應型香精的生產原料供應國際市場。為提高飲食健康，減少肥胖、高血壓等疾病的干擾，采用L-阿拉伯糖為原料生產反應型甜味香精將成為一種新的健康飲食方式。

通常以葡萄糖、果糖、木糖等還原糖作為美拉德反應原料制備風味物質，而用L-阿拉伯糖作為美拉德反應原料制備風味物質的實驗卻鮮有涉及。如周向軍等[8]則以甘氨酸-果糖、精氨酸-果糖為原料制備美拉德反應產物。周志磊等[9]用葡萄糖、果糖與脯氨酸發生美拉德反應，產生具有焦甜香的風味化合物，如2-乙酰呋喃、菠蘿酮和5-乙基麥芽酚。Wong等[10]研究酸性條件下葡萄糖與17 種氨基酸美拉德反應的呈味情況，研究發現甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和纈氨酸與葡萄糖反應可產生焦甜香；脯氨酸產生花香；丙氨酸產生水果香和花香；絲氨酸產生水果香等。

本實驗在先前研究[11]的基礎上，采用L-阿拉伯糖與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸在不同條件下發生美拉德反應生成反應型甜味香精，并分析比較其風味特征，為開發以L-阿拉伯糖為原料的甜味香精提供思路、借鑒和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-阿拉伯糖（食品級） 濟南圣泉唐和唐生物科技有限公司；丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸（食品級）河南潤誠食品配料有限公司；2-辛醇（內標，色譜級標準品） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；正構烷烴（C7～C30）、2,5-二甲基吡嗪、2,6二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5甲基吡嗪（色譜級標準品） 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ML104電子分析天平、FiveEsay Plus pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HHS-11-2數顯恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）頭 上海安譜實驗科技股份有限公司；HP-INNOWAX毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890 GC-5973C MS氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀 安捷倫科技有限公司；DF-101S熱恒溫油浴鍋 上海喬躍電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應產物的制備

按分組比例準確稱取L-阿拉伯糖與甘氨酸共2 g后倒入三口燒瓶中，然后向錐形瓶中添加20% 1,2-丙二醇溶液23 mL后振蕩搖勻并加熱制備美拉德反應香精。第1組：L-阿拉伯糖與丙氨酸美拉德反應條件[11-14]：pH 9.42，溫度80 ℃，L-阿拉伯糖∶丙氨酸0.3∶1，反應時間86 min；第2組：L-阿拉伯糖與甘氨酸美拉德反應條件：pH 9.13，溫度81 ℃，L-阿拉伯糖∶甘氨酸3∶1，反應時間53 min；第3組：L-阿拉伯糖與蘇氨酸美拉德反應條件：pH 9.26，溫度80 ℃，L-阿拉伯糖∶蘇氨酸0.33∶1，反應時間50 min；第4組：L-阿拉伯糖與絲氨酸美拉德反應條件：pH 8.13，溫度81 ℃，L-阿拉伯糖∶絲氨酸0.90∶1，反應時間51 min。

1.3.2 香氣物質SPME與GC-MS檢測

用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對揮發性和半揮發性成分進行SPME。在15 mL頂空瓶中加入7 mL反應香精，5 μL 2-辛醇，插入萃取頭，60 ℃平衡15 min后萃取30 min，250 ℃ GC解吸5 min，進行GC-MS分析[15-16]。

毛細管色譜柱型號：Agilent HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；采用不分流進樣模式；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；電子電離源，電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃，質譜接口溫度250 ℃，掃描范圍m/z 30～450[17-18]。

升溫程序：進樣口250 ℃，柱初溫40 ℃，保留6 min，以8 ℃/min升至100 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，保留20 min。

1.3.3 香氣物質的定性與定量

定性：通過檢出物質譜圖和NIST 05a.l、Wiley 7n.l數據庫（美國Agilent公司）中標準譜圖的比對；通過與標準品保留時間對比；與標準品的保留指數（retention index，RI）進行比對，沒有標準品的，與已報道文獻中RI進行比對。RI根據計算得到，按照樣品分析方法，取0.2 μL正構烷烴（C7～C30）混標注入GC-MS，通過烷烴混標的保留時間與樣品中揮發性成分的保留時間計算未知化合物的RI，計算見式（1）：

式中：RIX為未知化合物X的RI；tX為未知化合物X的保留時間；tZ、tZ+1為未知化合物相鄰前后的2 個正構烷烴的保留時間；Z為未知化合物X出現之前的正構烷烴的碳原子數。

定量：對于香氣活性值（odor activity value，OAV）大于1的物質，采用內標標準曲線法進行定量。以預測組分標準品與內標物的響應值之比為縱坐標、標準溶液質量濃度為橫坐標，得到內標標準工作曲線。通過標準曲線計算預測組分含量[19]。采用內標法對反應香精中的香氣化合物進行定量，按照公式（2）進行計算：

式中：CX為未知化合物X質量濃度/（μg/L）；f為校正因子（將校正因子設為1）；CO為內標2-辛醇質量濃度/（μg/L）；AX、AO分別為未知化合物X的峰面積和內標2-辛醇的峰面積。1.3.4 感官評價

參照食品感官評價原理與技術[20-22]，由8 名接受過專業感官培訓的成員組成感官評價小組，年齡均在23～28 歲之間。將需嗅聞的產品進行隨機編碼，并水浴加熱至30 ℃后進行嗅覺感官評價（烤香、青香、花果香、可可香）。采用10 分評分制，最后得分為各香氣得分平均值。

1.3.5 OAV計算

OAV定義為香氣化合物的含量與其在水中閾值的比值[23]，根據公式（3）[24]計算：

式中：F為樣品中香氣化合物質量濃度；T為香氣化合物的閾值。

1.4 數據處理

使用SPSS 20.0進行主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA相關數據進行中心化與標準化（1/Sdev）處理，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 揮發性風味化合物分析結果

由表1可知，L-阿拉伯糖分別與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸發生美拉德反應產生可可、烤香的風味。風味化合物為2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-乙基-6-甲基吡嗪。其中尤為突出的風味化合物為2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪。L-阿拉伯糖分別與蘇氨酸、絲氨酸發生美拉德反應產生帶有青香風味的化合物薄荷酮。L-阿拉伯糖與丙氨酸發生美拉德反應產生帶有花果香的風味化合物5-茚醇。

表 1 反應香精揮發性成分GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis of volatile components of Maillard reaction products (MRPs)

2.2 感官評價分析

表 2 各香氣感官評價結果Table 2 Sensory scores for intensity of aromas of MRPs

由表2可知，L-阿拉伯糖分別與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸發生美拉德反應均產生強烈的烤香和可可香。L-阿拉伯糖分別與蘇氨酸、絲氨酸發生美拉德反應產生中等強度的青香，相比之下L-阿拉伯糖分別與丙氨酸、甘氨酸反應產生的青香較弱。L-阿拉伯糖與丙氨酸發生美拉德反應產生中等強度的花果香。

2.3 關鍵揮發性風味化合物鑒定結果

若僅通過揮發性風味化合物含量確定香氣的貢獻度，并不能準確反映其對于美拉德反應產物香氣的貢獻程度，故而采用OAV討論美拉德反應產物中關鍵的揮發性風味物質。OAV＞1，香氣貢獻明顯，OAV越大則貢獻程度越大。OAV＜1，該風味物質不是關鍵風味物質，在產物中起協香作用。

對GC-MS檢測結果計算OAV，結果如表3所示（可查詢閾值物質），其中有7 種物質OAV大于1，這些物質被認為是美拉德反應產物的關鍵組分。其中6 種物質為吡嗪類物質，主要的風味特征為烤香和可可香。這與感官評價所得結果相似，感官評價中主要的感官屬性為烤香和可可香。由表3可知，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪OAV較大，故為美拉德反應產物中最關鍵的風味物質。

在檢測到的風味化合物中薄荷酮具有特有的青香風味，雖不是關鍵性風味物質，但仍能在反應產物中嗅聞到青香的風味。L-阿拉伯糖和蘇氨酸的美拉德反應產物中可嗅聞到淡淡的青香風味，但其他反應產物中青香味不明顯。

表 3 反應香精中揮發性物質的OAVTable 3 OAV of volatile components of MRPs

2.4 揮發性化合物PCA

如圖1所示，在第1象限中，與B4（可可香）相關的風味化合物為C9（2-乙基-6-甲基吡嗪）、C11（2,3,5-三甲基吡嗪）、C12（3-乙基-2,5-二甲基吡嗪）。由此可知C9、C11、C12主要貢獻可可風味。在第2象限中，與S3（L-阿拉伯糖與蘇氨酸美拉德反應產物）相關的感官屬性為B2（青香），相關的風味化合物為C15（薄荷酮）。第4象限中，與S1（L-阿拉伯糖與丙氨酸美拉德反應產物）相關感官屬性為B1（烤香）和B3（花果香），相關的風味化合物為C1（丙酮）、C4（2-甲基吡嗪）、C5（2,5-二甲基吡嗪）、C7（2-乙基吡嗪）、C10（2-乙基-5-甲基吡嗪）、C13（2-乙基-3,5-二甲基吡嗪）、C14（2-乙酰基吡啶）。其中C4、C5、C7、C10、C13主要貢獻烤香的風味，C1主要貢獻花果香。

圖 1 16 種揮發性風味化合物PCAFig. 1 PCA plot for 16 volatile flavor compounds

綜合圖1可知，產生烤香風味的C4、C5、C7、C10、C13與S1相關性較高。而由2.1節可知S2、S3、S4中也含有C4、C5、C10且含量較大，但低于S1中含量。綜合考慮可知S1產生的烤香最為濃厚，此結果與感官評價結果相同。產生花果香的5-茚醇僅存在于S1中，故S1中有花果香。產生青香的C15在S3中含量較高，且C15與S3相關性較高，故S3中青香味較其他物質中青香味大。

3 結論與討論

由于美拉德反應受pH值影響較大，尤其在pH值大于9的情況下會產生大量吡嗪類物質[26-28]。在L-阿拉伯糖與4 種氨基酸反應的美拉德產物中，產生的2,5-二甲基吡嗪含量最多，其為美拉德反應常見生成產物[29-32]。

L-阿拉伯糖與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸發生美拉德反應均可產生強烈的烤香、可可香風味物質，如2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-乙基-5-甲基吡嗪，且風味貢獻度較高，適用于添加到可可、咖啡、巧克力中。L-阿拉伯糖與蘇氨酸發生美拉德反應產生帶有淡淡的青香風味物質薄荷酮，適用于添加到飲料、香煙和糖果中。L-阿拉伯糖與丙氨酸發生美拉德反應產生帶有微弱的花果香風味物質5-茚醇、丙酮。本實驗探究L-阿拉伯糖分別與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸發生美拉德反應生成的甜味香精揮發性風味化合物，并分析比較風味特征及對其主要風味物質的反應機理進行探討，為今后甜味香精的開發提供新的方向。