響應面法優化酶解低溫榨取漢麻籽油工藝

王 雯，王睿智，王 彤，王立琦，朱秀清,*，石彥國,*，于殿宇

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，谷物食品與谷物資源綜合加工省級重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150065；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150038）

漢麻籽也稱火麻籽[1]，其主要成分是蛋白質和脂肪，微量營養元素Ca、K、Mg、Mn等含量也較為豐富[2-3]。漢麻籽呈卵圓形微扁，因品種而不同[4]。漢麻籽仁脂肪質量分數35%～50%，蛋白質質量分數20%～40%，膳食纖維質量分數10%～40%[5-6]。漢麻籽油作為食品和天然保健用品的原料，具有活血通潤的效果[7-8]，對于免疫系統具有很好的藥理作用[9]。用于食品開發的漢麻籽中Δ9-四氫大麻酚含量通常低于10 μg/g（以種子計）[10-11]。

目前，漢麻籽油的提取方法主要有溶劑萃取法、熱榨法及冷榨法、超聲輔助提取法等[12-14]，這些方法雖然技術成熟，利于工業化生產，但存在不容忽視的問題[15-16]。溶劑萃取法提取油脂會造成一定的溶劑殘留，需要在較高溫度下才能脫除。熱榨法需要在高溫下進行預處理調質，高溫下進行壓榨[17]。漢麻籽油中有80%以上的多不飽和脂肪酸，高溫易導致漢麻油過氧化值升高，很多天然營養成分被破壞，不但降低了原有的生物活性，而且降低了生物利用度[18-19]。低溫冷榨制油法屬于壓榨法的一種，是指油料作物在入榨前不經過蒸炒等高溫處理，入榨溫度較低的榨油方法[20-21]。低溫冷榨法制得油脂的天然成分、營養物質的流失少，避免了熱榨法高溫處理帶來的不利影響[22-23]。在較低溫度下對漢麻籽進行壓榨提取油脂，最大限度地保持了漢麻籽油的天然組分和結構[24-25]，但出油效率較低，資源利用度不高。

本研究在國內外大量相關文獻的基礎上，以漢麻籽仁為原料，在低溫條件下進行初榨，得到部分功能性較好的初榨油，由于初榨溫度較低，餅中殘油較高，因此嘗試在初榨餅中加入Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L堿性蛋白酶進行酶解，再進行低溫復榨，榨取初榨餅中剩余部分油脂，以獲得更高的出油效率，同時期望漢麻籽油理化指標穩定，油中功能性成分仍保留完全，為研究酶解低溫榨取漢麻籽油提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢麻籽（脂肪質量分數40.2%，蛋白質質量分數30.6%，纖維素質量分數15.7%） 黑河市格潤公司；Viscozyme L植物水解酶、Protex 6L堿性蛋白酶 諾維信生物技術有限公司；大麻酚溶液（1 mg/mL）、生育酚（純度≥97%，1 000 IU/g） 美國Sigma公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 中國試劑網；所有實驗用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SG30-2B型螺旋榨油機 肇慶市鼎湖景日晟機械有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實驗儀器廠；PHS-25C數字酸度計 上海大浦儀器有限公司；N24120型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；SX-520-A10-G50-M型芯式過濾器 上海薩爾設備有限公司；RV10型旋轉蒸發儀 上海圣科儀器設備有限公司；SU-8010場發射掃描電子顯微鏡、ES-2030型冷凍干燥儀、E-1010型離子濺射鍍膜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

稱取一定量的漢麻籽仁，水分調節至4%，榨膛溫度50 ℃，壓力3.5 MPa，計量低溫初榨毛油，測定初榨餅中含油質量。將初榨餅粉碎，過60 目篩，為使其在低溫條件下出油，加入3.0% Viscozyme L植物水解酶進行酶解，用PBS調節至pH 4.8，恒定溫度50 ℃，保持時間4.5 h后，加入纖維素酶破壞漢麻籽中的纖維，再加Protex 6L堿性蛋白酶充分混合，使其破壞油脂與蛋白的結合，用PBS調節至pH 8.0進行酶解，在壓力3.5 MPa、溫度50 ℃條件下進行壓榨。本實驗以出油效率為指標，研究加酶量、pH值、時間、溫度對酶解的影響，并對漢麻籽油基本理化指標和功能性成分進行分析。

1.3.2 Protex 6L堿性蛋白酶酶解初榨餅單因素試驗

研究漢麻籽油在酶解低溫壓榨工藝中酶解參數的優化，根據預實驗選擇加酶量、pH值、時間和溫度4 個因素對初榨餅酶解低溫壓榨進行單因素試驗。選擇酶解工藝優化的條件分別為：堿性蛋白酶加酶量1.2%、pH 10.5、時間3 h、溫度50 ℃。在榨膛壓力3.5 MPa條件下，研究堿性蛋白酶加酶量分別為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6% 時對出油效率的影響；研究酶解pH值分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5時對出油效率的影響；研究酶解時間分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h時對出油效率的影響；研究酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時對出油效率的影響。

1.3.3 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計[26]，以加酶量（A）、pH值（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）為優化條件，以出油效率（R）為響應值設計4因素3水平響應面試驗，因素與水平設計見表1。

表 1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.4 冷榨餅掃描電鏡樣品制備與觀察

將低溫初榨餅和酶解低溫復榨餅分別切成2.0 mm×3.0 mm條形，加入2.5%、pH 6.8戊二醛油狀液體，并置于4 ℃冰箱中固定1.5 h。取出樣品后用0.1 mol/L、pH 6.8的PBS沖洗3 次，每次10 min。再分別用體積分數為50%、70%、90%的乙醇溶液進行脫水各1 次，每次12 min；無水乙醇脫水2 次，每次12 min。置換方法采用無水乙醇-叔丁醇（體積比1∶1）和叔丁醇各1 次，每次15 min。然后將樣品放入-20 ℃的冰箱中冷凍30 min，取出后再進行冷凍干燥4 h。鍍金膜厚度100～150 ?。

1.3.5 指標測定

各指標測定分別參照GB 5009.236—2016《動植物油脂水分及揮發物的測定》、GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》、GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》、GB/T 14488.1—2008《植物油料 含油量測定》、GB 5009.82—2016《食品中維生素A、D、E的測定》。

漢麻籽油植物大麻素測定參照Citti等[27]的方法。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 初榨餅的殘油率

經過低溫初榨后，測得初榨餅的殘油率為21.6%。

2.2 Protex 6L堿性蛋白酶酶解初榨餅單因素試驗結果

2.2.1 加酶量對出油效率的影響

圖 1 加酶量對出油效率的影響Fig. 1 Effect of enzyme amount on oil yield

從圖1可以看出，隨著堿性蛋白酶的增加，出油效率隨之上升，當堿性蛋白酶增加量過大時，出油效率反而下降。當堿性蛋白酶的使用量為1.0%，出油效率達到最大值，這是因為在一定范圍內隨著加酶量的增加，有更多的酶分子和底物相互作用，從而增加出油效率，但是當加酶量過大時，底物逐漸被酶所飽和，剩余的酶分子沒有底物可以利用，同時酶的活性中心會被其他過量的酶所覆蓋，影響酶解效率[28]，使得出油效率不再增加而趨于平穩，所以本實驗選取加酶量1.0%作為后續研究參數。

2.2.2 酶解pH值對出油效率的影響

圖 2 pH值對出油效率的影響Fig. 2 Effect of pH on oil yield

從圖2可以看出，pH值在9.0～10.0，出油效率呈現上升趨勢，在pH值到達10.0時，出油效率達到最大，當pH值大于10.0時，出油效率呈現下降趨勢，這是因為酶對反應體系的pH值有一定的敏感性，pH值可以改變酶分子的空間構象，并影響酶分子與底物之間的結合，當pH值為10.0時，可使酶的活性位點外露，增加酶活力，使得出油效率達到最高。所以本實驗選取pH 10.0作為后續研究參數。

2.2.3 酶解時間對出油效率的影響

圖 3 酶解時間對出油效率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis time on oil yield

從圖3可以看出，在酶解時間1.5～2.5 h的范圍內，隨著酶解時間延長，出油效率呈現上升趨勢，酶解2.5 h時出油效率達到最大值，隨后趨于平穩，這是因為隨著酶解時間的延長，酶分子與底物可以充分接觸，進行酶解反應。但是，隨著酶解時間的延長大多數底物已經被酶解，致使其出油效率增加緩慢，從生產效率上講，時間延長會使生產效率降低[29]。所以本實驗選最適酶解2.5 h作為后續研究參數。

2.2.4 酶解溫度對出油效率的影響

圖 4 酶解溫度對出油效率的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on oil yield

從圖4可以看出，出油效率呈現上升后下降的趨勢，當酶解溫度小于50 ℃時，出油效率隨著酶解溫度的升高而逐漸增加，當酶解溫度超過50 ℃后出油效率明顯下降。這主要是因為酶解溫度升高可以使反應體系中分子運動速率上升，提升了底物和酶的接觸幾率，加速酶解反應進程；但是酶解溫度過高會使維持酶分子結構的次級鍵斷裂，使其部分失活，從而降低了酶活性，延緩了酶解進程，使得出油效率下降，所以本實驗選取酶解溫度為50 ℃作為后續研究參數[30]。

2.3 二次回歸方程的建立分析與驗證

表 2 響應面設計方案及結果Table 2 Box-Benhnken design with experiment results for response surface analysis

響應面試驗設計方案及結果見表2，利用Design-Expert 8.0.6軟件對結果進行方差分析，將數據進行多元回歸擬合，得到出油效率（R）與加酶量、pH值、時間、溫度的二次響應面回歸方程為：

R=63.6+2.00A+0.75B+2.08C+1.83D+0.50AB+1.25AC+0.75AD-0.25BC-1.00BD+0.75CD-2.80A2-1.92B2-2.93C2-2.55D2

利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行方差分析，結果見表3。

表 3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance

由表3可知，回歸方程的因變量與自變量之間存在的線性關系明顯，整體模型的P值小于0.000 1，模型極顯著，失擬項P值為0.709 2，失擬項不顯著，表明該模型選擇正確，模型中的調整系數R2Adj為97.64%，說明97.64%的響應值變化可以通過模型進行解釋，相關系數R2為98.82%，表明該模型與試驗擬合良好，可以用此模型進行分析和預測。

圖 5 酶解參數交互作用對漢麻籽出油效率的影響Fig. 5 Response surface plots showing the effect of interaction between hydrolysis parameters on oil yield

從圖5可以看出，4 個變量在兩兩交互時，保持其中2個變量不變，隨著另外2 個變量的增加，出油效率呈現先上升的趨勢，當達到一定值時又呈現出下降趨勢。其中隨著AC、BD、AD、CD交互作用為極顯著，BC和AB不顯著，通過優化得到漢麻籽仁初次冷榨餅酶解過程的最佳工藝參數為加酶量1.11%、pH 10.05、時間2.77 h，溫度52.50 ℃，該條件下出油效率預測值為65.20%。根據實際情況將工藝參數進行整理，得出整理值為加酶量1.1%、pH 10.0、酶解時間2.8 h、酶解溫度52 ℃。在此條件下進行3 次平行驗證實驗，該條件下出油效率平均值為65.0%。實測值與預測值之間具有良好的擬合性，從而證實了模型的有效性。

2.4 低溫初榨餅酶解效果掃描電鏡分析

由圖6A可見，漢麻籽仁經過低溫初榨后，微觀組織結構在榨膛機械力作用下發生了一定的變形和破裂，為酶制劑滲透及酶解創造了有利條件。低溫初榨餅經過Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L堿性蛋白酶酶解后（圖6B），細胞壁受到水解性破壞，細胞內部分油體及蛋白體外露，圖中可見，低變性蛋白體發生結構性破壞，油體蛋白脫離油體磷脂單分子膜，導致油體開放性崩解，油脂明顯聚集溢出，為酶解低溫復榨創造了有利條件。

2.5 漢麻籽油指標分析

表 4 漢麻籽油基本理化指標分析Table 4 Physicochemical properties of hemp seed oils

表4數據顯示，酶解低溫復榨漢麻籽油的理化特征指標與低溫復榨（對照組）比較，均無顯著性差異（P＞0.05），結果表明，酶解低溫復榨工藝方法對漢麻籽油基本理化指標沒有明顯的影響。

表 5 漢麻籽油功能性成分分析Table 5 Analysis of functional components of hemp seed oils

從表5可以看出，低溫復榨漢麻籽油中植物大麻素含量為124.56 mg/kg，酶解低溫復榨漢麻籽油中植物大麻素含量為130.89 mg/kg，無顯著性差異（P＞0.05）。酶解低溫復榨與對照組比較植物大麻素的含量略有提高，表明酶解低溫復榨工藝方法有利于植物大麻素向油相的遷移。

低溫復榨漢麻籽油中生育酚的含量為698.27 mg/kg，酶解低溫復榨漢麻籽油中生育酚含量為715.18 mg/kg，無顯著性差異（P＞0.05）。分析認為，Viscozyme L植物水解酶的預酶解導致漢麻籽細胞壁水解，生育酚與多糖的絡合作用減弱，從而增強了向油相的遷移，釋放出更多的生育酚。

3 結 論

在響應面試驗優化條件下，對殘油率為21.6%的漢麻籽仁低溫初榨餅進行酶解低溫復榨，獲得的出油效率為65.0%；經過Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L堿性蛋白酶酶解后，掃描電鏡觀察到初榨餅粉細胞壁破壞和油脂溢出聚集明顯，這種狀態有利于提高壓榨過程中油脂的流動性；酶解低溫復榨漢麻籽油的基本理化指標與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），植物大麻素及生育酚含量增加。酶解低溫榨取漢麻籽油，借助Viscozyme L植物水解酶破壞初榨餅粉的細胞壁纖維網絡，暴露其內部的蛋白體與油體蛋白，利用Protex 6L堿性蛋白酶降解蛋白，釋放油脂，通過低溫壓榨制取漢麻籽油，該工藝方法具有出油效率高、理化指標穩定、功能性成分對油相的分配增強等優點，可以替代常規低溫壓榨或低溫復榨提取漢麻籽油的方法。