基于生物信息分析技術的精準醫療

猶龍江

(貴州大學動物科學學院 貴陽 550025)

1 引言

2015年1月20日美國總統奧巴馬宣布啟動精準醫學計劃并決定一期投入約2億美元。2015年12月11日在上海成立“中國個體化用藥-精準醫學科學產業聯盟”，標志我國正式開始精準醫療的探索。同年召開首次精準醫療戰略專家會議，最終決定在2030年前對精準醫療領域投入600億元。精準醫療根據患者基因、生活環境和方式的個體特異性推測疾病的發生，從而采取有效、精準的疾病預防與治療手段。精準醫療的發展是建立在目前科學技術快速發展基礎上的，如人類全基因組測序、生物信息分析技術、大數據分析工具等。當前精準醫學用于人類癌癥治療靶向藥物的創新臨床實驗、綜合性用藥選擇以及克服個體耐藥性。

人類基因組計劃(Human Genome Project,HGC)的目標是解碼生命，了解生命起源、成長與衰退；認識個體之間的差異性原因，對人類疾病的發生機制、致病機制提供科學依據，同時極大促進相關行業的發展。如基因測序技術、功能基因組學、比較基因組學、生物信息學、計算生物學等。其中生物信息學和計算生物學是對物種個體基因的基礎且關鍵的分析技術，分析人員掌握技術的熟練程度與分析結果有密切聯系。

2 生物信息學概述

2.1 基本技能

生物信息學與計算生物學之間界限比較模糊，生物信息學側重對數據的提取、挖掘，而計算生物學側重對數據的處理、運用。目前生物信息學和計算生物學在處理對象和方法上已無顯著差別，分析方法大同小異、流程相似。生物信息學需掌握的技能是運用開源數據分析工具挖掘海量的基因測序數據，而對數據分析的能力決定對復雜生命認識與理解。在進行生物信息學分析之前應掌握以下幾點：(1)可利用Shell、R、Python等計算語言編寫腳本將機械性的文件處理操作轉化為簡單的指令運行。(2)使用強大的Linux(Unix)系統運行開源數據處理程序。(3)掌握R語言的探索性數據分析方法。(4)了解基因組數據文件格式。如FASTA、FASTQ、SAM、BAM等。(5)具有一定的分子生物學知識背景。2001年后至今被稱為后基因組時代，完成人類基因組測序、各種模式生物基因組測序，基因組學的研究重心也轉向功能基因組學。

2.2 研究方向與應用

經過十幾年的發展現已形成多個研究方向，根據分析數據來源不同，主要分為全外顯子測序分析、轉錄組測序分析、染色質免疫共沉淀測序。以往生物信息學研究領域重點在于基因表達譜、個體物質代謝網絡、基因芯片設計和蛋白質數據分析。進入后基因組時代其研究領域有了重大發展——擴展至結構基因組學、功能基因組學、比較基因組學、蛋白質組學、藥物基因組學、腫瘤基因組學、分子流行病學和環境基因組學。

3 生物信息學分析流程

3.1 全外顯子測序分析技術

通過捕獲全基因組的外顯子區域、富集后進行高通量測序，能夠直接發現與蛋白質功能變異相關的遺傳變異。人類基因組中外顯子僅占約1%[1]，但作為編碼蛋白質的序列區域，且超過85%的孟德爾遺傳病都與基因組外顯子變異有密切聯系，更適用于臨床發現、確診部分孕期疾病[2]。目前產前診斷常用方法是B超影像學檢查，發現胎兒異常后采用核型分析或染色體微陣列芯片等技術，綜合診斷率約14～16%[1-2]，更高效、精確的診斷技術迫切需要。WES的臨床推廣運用可能將孟德爾遺傳病診斷率提高到20～80%。全外顯子測序分析具體流程，見圖1。外顯子測序后獲得原始數據，過濾除去高通量測序時插入的接頭引物，然后與從公共數據庫(如NCBI、Ensemble等)獲取的參考基因組進行比對，找出突變編碼區，篩選出與遺傳疾病相關的基因變異，成為候選基因并進行討論和分析，總結實驗結果。通過全基因組外顯子測序分析技術不僅能有效、準確地定位致病基因位點，還能發現新的突變位點的致病基因，對闡明相關疾病發病機理、機制、遺傳診斷具有重要的研究和推廣價值。此外不依靠昂貴、精確的大型設備儀器，而是多依據計算機對測序數據的處理及分析人員對公共數據庫的理解和運用。該技術在臨床疾病研究中具有推廣與應用價值。

圖1 全外顯子測序數據的生物信息學分析流程

3.2 轉錄組測序分析技術

指特定組織或細胞發生在某一階段或功能狀態下轉錄出來的核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)總和，主要包括mRNA和非編碼RNA(ncRNA)。轉錄組學是對基因結構、功能新的研究出發點，是對研究對象在特定發育階段下的分析。相比全基因組分析，轉錄組分析具有更高的靈敏度，可以精確識別可變剪切位點、基因的表達水平；對任意物種的全基因組分析甚至可能發現新的轉錄本、檢測融合基因[3]。組學分析將可能為中醫理論中的陰陽學說進行科學分析與數據結果實踐證明。通過分析陽類和陰類急性缺血性中風，可以使用部分差異lncRNA和miRNA作為潛在疾病診斷的標記物，是十分具有潛力的研究方法。

4 基于生物信息分析技術的精準醫療

4.1 精神疾病藥物使用指導

4.1.1 第2類精神藥物依賴 近年修改《麻醉藥品和精神藥品管理條例》有關規定，國家食品藥品監管總局、公安部、原國家衛生計生委決定將含可待因的復方口服液體制劑(包括口服溶液劑、糖漿劑)列入第2類精神藥品管理[4]。其原因在于對敏感藥物基因的臨床實驗發現CYP2D6超快代謝哺乳期婦女，分泌到乳汁中可待因可能出現藥物過量，導致乳兒可能出現致死性不良反應[5]。隨著研究人員對藥物代謝相關基因的研究，對部分藥品的使用說明書進行修改，體現出現代醫學對精準用藥的要求。隨著測序技術以及相關行業的發展，目前進行指定藥物相關基因的檢測費用約3 000元/次，周期為3～4天，檢測結果終身有效。

4.1.2 指導精神藥物使用 武漢市優撫醫院通過精神疾病患者的臨床癥狀、基因檢測分析結果為其制定精準治療方案[6]。取患者口腔上皮細胞進行藥物基因檢測，結合臨床用藥結果分析，該患者應選用CYP2D6基因型廣泛代謝型藥物，典型藥物有奮乃靜、氟哌啶醇等。

4.2 敏感性藥物基因篩查

4.2.1 通過敏感性藥物基因檢測實現個體化用藥 根據用藥患者個體差異引起的藥物吸收、轉運、代謝等不同而實現有效的聯合用藥、精準治療，降低患者對藥物的耐受性和用藥成本。藥物基因檢測常用方法有3種：實時熒光定量PCR(qPCR)、熒光原位雜交(FISH)、基因測序技術。qPCR技術常用于對藥物干擾基因mRNA的表達水平的檢測，判斷使用相關藥物的療效。FISH是使用熒光探針技術對藥物或疾病相關基因的檢測。而測序技術通過對個體全基因組測序后進行生物學分析，篩選出潛在的遺傳疾病和相關治療藥物蛋白基因多態性。如細胞色素P450為自身氧化的亞鐵血紅蛋白家族，又稱多功能氧化酶，多參與內源性物質的代謝。CYP2D6基因型為CYP450酶系中重要的一種并且是唯一一種不能被誘導的酶。研究表明CYP2D6參與臨床常用藥物的體內代謝[7]，如奮乃靜、氟哌啶醇等抗精神疾病藥物，氯丙嗪、美沙酮等鎮靜類藥物，吉非替尼片、他莫昔芬等抗腫瘤藥物。

4.2.2 腫瘤領域個體化用藥案例 香港中文大學莫樹錦教授的臨床實驗說明藥物基因檢測的潛在價值。該試驗目的是探究易瑞沙是否提高亞洲肺癌患者的生存期望，首次引入基因檢測因素，將服用藥物的患者進行表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Recepter，EGFR)基因檢測。實驗結果證實易瑞沙對敏感EGFR突變患者具有良好的治療效果，也提示非敏感患者應接受常規治療方案。該實驗是腫瘤治療領域率先引入的個體化用藥案例之一。

4.3 個體疾病潛在的精確診斷方式

4.3.1 診斷疾病的分子標記物 隨著測序、序列分析技術的不斷發展，許多常見和罕見的系統疾病分子標記物被確定，如阿爾茨海默癥(Alzheimer′s Disease,AD)、帕金森癥(Parkinson′s Disease,PD)、多發性硬化癥(Multiple Sclerosis,MS)等。盡管疾病的發生存在多因素與異質性的影響，但是分子標記物的確定能作為疾病精確診斷的方式。就AD而言，目前已證實遺傳因素在其病理機制中扮演重要角色[8]。2011年的文獻證實基因APP、RSEN1和PSEN2的遺傳突變直接導致早發性阿爾茨海默癥(Early Onset Alzheimer′s Disease，EOAD)，但是之后在出現EOAD的臨床患者中并沒有檢測到這3個基因的突變。隨著研究深入目前已發現3個機制不明的小家系EOAD的遺傳因素。第1個為NOTCH3基因的錯義突變[9]；第2個在SORL1的錯義和無意義的突變[10]；第3個為在腦小膠質細胞中表達的免疫吞噬受體TREM2外顯子2變異與AD的早發性和遲發性具有密切聯系[11]。通過不斷的研究發現疾病的致病因子很多，機制也很復雜。

4.3.2 腫瘤篩查領域 在腫瘤疾病研究領域中基因變異檢測是精準醫療中重要的組成部分[12]。臨床腫瘤患者多用組織活檢技術，結果不完全準確，存在65%的假陽性[13]。但基因檢測技術可以將癌癥的診斷提前到細胞癌變階段，為腫瘤的預防提供基因水平上的指導。

5 討論

5.1 生物醫學大數據應用

5.1.1 價值與意義 目前正處于由基因組學、蛋白質組學、代謝組學、影像學、臨床診斷數據等構成的生物醫學大數據時代。對生物醫學數據信息的理解、運用將擴展為現階段對患者從診斷到預防再到個性化治療的疾病管理新模式。如果使用得當大數據將成為具有重要價值的資源，用于改善當前的醫療服務和降低醫療成本。到2022年美國醫療保健占GDP的比例預計達到19.9%[14]。中國是人口大國的新興經濟體，尤其是新的高通量測序平臺、實時成像系統、亞洲基因數據庫建立將極大促進中國未來生命科學發展。

5.1.2 構建相關數據庫 生物信息學發展從個體基因組測序擴展到測量表觀基因組數據，研究基因的表達過程不僅僅局限于DNA序列的修飾，如DNA甲基化修飾、His-tone修飾[15]。生物信息的獲取除基因組學外還包括轉錄組組學、蛋白質組學、代謝組學等。而組學就是強調對生物體結構、功能和生物分子動力學進行集體的量化。大數據可以提高臨床研究實用性，有助于有效精確地對患者進行分類，這是定制個性化醫療方案和充分利用醫療資源的關鍵點。從人口學角度出發，研究某人疾病的發生過程可以用來預測和預防同樣疾病的發生，構建中國生物醫學數據庫具有重要的戰略意義。

5.2 現階段精準醫療爭論

5.2.1 基因檢測商業化 基因檢測技術在醫學檢查、疾病診斷、精準用藥等方面發揮巨大作用。這項檢測使一些重大慢性疾病治愈率大幅提高，基因檢測逐步被接受，用于商業化使用[16]。基因測序是精準醫療的基礎，藥物基因的篩選雖然提高治療藥物的準確性，但是也限制治療藥物的使用。血液腫瘤學家維奈·普拉薩德(Vinay Prasad)于2016年在《自然》發表相關文章，指出絕大多數的腫瘤患者并沒有通過個體化的精準醫療方案提高生存幾率、生活質量，相反帶來的是額外的昂貴醫療費用[17]。但筆者認為目前個體化治療方案的失敗更多的可能是目前方法學理論的失敗[18]。根據2018年5月在北京召開的中國消費級基因檢測行業峰會，如果參照美國基因檢測近5年的滲透率變化，2020年中國的滲透率達到3.5%。

5.2.2 藥物精準使用 對患者進行藥物敏感性基因篩查，除篩查結果終身可參考使用外還能為醫生臨床治療用藥提供指導，減少不敏感藥物的使用，降低患者多次使用不同藥物產生的藥物耐受性，減少治療負擔。實現有效用藥從而避免患者多次重復就診和藥物使用，充分有效利用醫院和藥品資源。

5.3 生物信息學人才培養

5.3.1 引導學生興趣 基因組學研究基因突變或差異產生的個體差異性，轉錄組學和蛋白質組學研究某種外因對個體產生的影響，而代謝組學則是在研究個體目前的差異性變化。基因在細胞核中轉錄出信使RNA，然后翻譯為功能性蛋白質，參與復雜的生命活動行為。利用開源軟件分析數據，掌握一門匯編語言，具有一定的分子生物學知識背景，是生物信息學分析的基礎要求。學生開始學習時應多了解最新研究開發出的開源數據挖掘軟件、分析算法、流程、數據庫、大量的高質量文獻和具有重復性的代碼參考。然后根據興趣選擇研究方向，包括計算生物學、基因組學、轉錄組學等。

5.3.2 完善培養方案 相關文獻每年發表總量增長說明生物信息技術廣泛用于生命科學研究。在臨床應用中醫學信息學利用患者疾病現階段的全外顯子測序或轉錄組測序，篩選出致病突變基因，選擇靶向用藥，實現精準醫療[6]。在精準醫學用于人類腫瘤治療靶向藥物的創新臨床實驗、使用選擇以及克服個體耐藥方面，生物信息技術是最關鍵、最基礎的分析技術[12]。生物信息學在科學領域的研究和臨床實踐的實用價值以及專業人才分類說明研究行業對該專業人才的需求。高校應注重該專業人才培養，提出相適宜的人才培養方案體系。

6 結語

目前的疾病診斷和治療主要依賴于患者的主觀感受、病史資料、醫生的主觀辨別和大量昂貴設備輔助診斷結果，在臨床治療過程中不斷進行驗證和修改治療方案。在未來的疾病診斷方面，尤其是惡性疾病的早期診斷，疾病相關基因分子標記物的篩查具有重要意義。隨著基因組學研究、疾病機制和相關基因分子標記物不斷發現和證實，疾病基因分子標記確定精確性不斷提高，未來有望實現血液中分子標記物的PCR定性檢測和qPCR的定量檢測，大大提高疾病正確診斷率。個體化的精準醫療方案雖然因個體基因的多態性而缺乏特異性的靶向治療藥物，但筆者認為這項技術為患者提供更適合的醫療方案，又避免不敏感靶向治療藥物的使用，同時也為新型靶向藥物的研究提供方向。隨著測序技術不斷升級，分析方案不斷優化，檢測成本不斷下降以及靶向治療藥物的開發，未來有望將基因檢測納入醫保政策。