發酵方式對薏仁碎米醬油品質的影響

牟燦燦，盧紅梅*，陳莉，常冬妹，吳煜樟

(1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴陽 550025; 2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025)

薏仁米(coix seed)，為禾本科草本植物薏苡的成熟種仁[1]，又名薏苡仁、薏米等，是一種藥食同源的優質禾谷物[2，3]，其營養價值和保健價值在禾本科植物中居于首位，不僅富含優質的蛋白質、脂肪、淀粉、粗纖維、礦物質、維生素等營養成分，還含有酚類、甾醇類、三萜類、酯類、多糖類和生物堿類化合物等藥效成分[4]；據《本草綱目》記載，薏仁具有“健脾益胃，補肺清熱，怯風勝濕，養顏駐容，輕身延年”之功效[5]，經臨床藥理研究表明，薏仁米具有抗腫瘤、抗炎、免疫調節、抗癌、降血糖、消炎鎮痛止血和抑制骨質疏松等多種藥理活性[6-8]。目前，薏仁米的加工模式較為粗放，在整米加工過程中會產生大量碎米、薏仁殼、薏仁麩皮等副產物，且回收利用不充分，從而造成薏仁米資源的浪費。薏仁碎米與整米的營養價值相當，且價格僅為整米的1/6[9-11]。因此，用薏仁碎米代替傳統豆粕麩皮醬油中的麩皮釀造醬油不僅能將薏仁米豐富的營養成分和藥用價值引入醬油，還能豐富薏仁米的產品種類，延長其產業鏈，并提升薏仁米的附加值。

醬油是以大豆/脫脂大豆和小麥/麩皮作為原料，經微生物發酵而成的具有色、香、味、體的調味品[12,13]。醬油的發酵工藝主要有高鹽稀態、低鹽固態和自然發酵等[14]。其中高鹽稀態發酵醬油傳承了我國的傳統工藝，以大豆/脫脂大豆和小麥/麥麩為原料，通過蒸煮和曲霉菌制曲后，與鹽水混合形成稀醪，再經發酵而成，發酵期一般在6個月以上，有利于發酵更徹底，使醬油品質更高，香氣成分更多，營養物質更豐富，酯香突出，口感更鮮美等[15]；低鹽固態發酵醬油是以脫脂大豆、麥麩為原料，同樣經蒸煮、曲霉菌制曲后，與鹽水混合形成固態醬醅，再經發酵制成，其發酵時間一般為1～3個月，具有顏色暗沉、口感濃厚、味道鮮美、對操作技術要求不高、出品率較穩定、性價比高等優點[16,17]，但由于其發酵溫度較高，發酵周期短，不利于酶系的反應及產香酵母的生長，從而影響醬油整體的風味和質量[18]；自然發酵醬油則是采用天然曬露方式進行釀造，參與發酵的菌種多而繁雜，鹽水濃度高，故制得的醬油顏色暗沉，伴有濃郁醬香，味道鮮美且醇厚，但該工藝因受氣溫和環境的影響較大，從而影響醬油的風味和品質，且具有發酵周期過長、原料利用率低、季節性強、菌群不明、周轉緩慢、衛生條件不易控制等缺點[19]。不同發酵工藝直接影響最終醬油的風味和品質，本文通過分析3種發酵工藝的醬油在釀造過程中還原糖、總酸、氨基酸態氮、全氮、可溶性無鹽固形物和有機酸等理化指標的變化，研究不同發酵工藝對薏仁碎米醬油品質的影響，旨在為提高薏仁碎米醬油的品質提供理論依據和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

薏仁碎米為貴州興仁縣產純種小薏仁米，來源于貴州興仁縣貴州興誠華英食品有限公司；曲種、豆粕，來源于貴陽味莼園食品(集團)有限公司；醬醪，來源于前期薏仁碎米醬油發酵過程中樣品(經工藝優化確定最佳的制曲工藝為豆粕與薏仁碎米比例為3∶2，米曲霉接種量為0.20%，制曲溫度為34.5 ℃，制曲時間為49.5 h，每16 h翻曲1次，鹽水濃度為18 °Bé，其添加量為原料的2倍)。

1.1.2 主要試劑

乳酸 重慶川江化學試劑廠；硫酸 天津化學試劑三廠；硫酸鉀 天津市大茂化學試劑廠；甲醛 成都金山化學試劑有限公司；硫酸銅 天津市北聯精細化工開發有限公司；葡萄糖 天津市協和昊鵬色譜科技有限公司；氫氧化鈉 重慶茂業化學試劑有限公司；硼酸 天津市瑞金特化學品有限公司。以上試劑均為分析純(AR)。

1.2 主要儀器設備

FA2004N電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；pHS-3C數顯酸度儀 上海虹益儀器儀表有限公司；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫用核子儀器有限公司；CJJ-781磁力攪拌器 城西曉陽電子儀器廠；220V.AC 1000W萬用電爐 天津市泰斯特儀器有限公司；CLHN-350T型恒溫恒濕培養箱 天津市華北實驗儀器有限公司；HH-b型數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；THZ-92C臺式恒溫振蕩器 上海浦東物理光學儀器廠；UV-7520 PC型紫外可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；KDN-O8B定氮儀 上海新嘉電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 醬醪取樣

將醬醪在無菌條件下攪拌至均勻，各稱取10.00 g，并用100 mL容量瓶定容，靜置后過濾，待測。

1.3.2 醬醪中各理化指標的測定

包括醬醪中全氮、氨基酸態氮、還原糖、無鹽固形物、總酸及有機酸含量的測定，具體測定方法參照GB/T 18186-2000《釀造醬油》[20]。同時以豆粕麩皮為原料，以相同條件下釀造的傳統醬油為對照。

1.3.3 數據處理與分析

采用Origin 8.6、Excel 2016等軟件對試驗數據進行處理，每個處理組進行3次平行試驗。

2 工藝流程及要點

2.1 工藝流程

高鹽稀態薏仁碎米醬油的發酵工藝流程見圖1。

圖1 以高鹽稀態薏仁碎米醬油為例的發酵工藝流程Fig.1 Fermentation process of soy sauce with high salt dilute state cracked coix seed as an example

低鹽固態發酵工藝僅用對鹽水濃度、溫度及鹽水量，控溫發酵的溫度和時間與其不同；自然發酵工藝則是將樣品置于通風向陽處進行發酵，不進行控溫發酵；而傳統發酵工藝是以豆粕和麩皮為原料進行發酵。

2.2 工藝要點

2.2.1 高鹽稀態發酵

鹽水濃度18 °Bé(20 ℃)，高溫制醪，鹽水溫度40 ℃，鹽水用量為原料量的2倍，制醪時應將成曲適當破碎，以便迅速和均勻吸收鹽水；發酵溫度 35 ℃，發酵時間180天。

2.2.2 低鹽固態發酵

鹽水濃度13 °Bé(20 ℃)，鹽水溫度50 ℃，鹽水用量使醬醅初始水分為55%，制醅時成曲應適當破碎，以便迅速和均勻吸收鹽水；發酵溫度40 ℃，發酵時間90天，隨后將發酵溫度調至35 ℃，便于與高鹽稀態及自然發酵醬油中的理化指標進行對比，繼續發酵至180天。

2.2.3 自然發酵

鹽水濃度18 °Bé(20 ℃)，常溫制醪，鹽水溫度25 ℃，鹽水用量為原料量的2倍，制醪時應將成曲適當破碎，以便迅速和均勻吸收鹽水。將樣品放入玻璃容器內，靜置于樓頂通風向陽處，起始發酵溫度約為24 ℃，發酵時間為180天。

2.2.4 壓榨

經人工擠壓分離，靜置過濾得生醬油。

3 結果與分析

為便于對比分析3種發酵方式在發酵180天內醬油的理化指標(包括還原糖、總氮、氨基酸態氮、有機酸、總酸和可溶性無鹽固形物等)的變化，因此，在低鹽固態醬油發酵完成時仍繼續取樣檢測。

3.1 發酵過程中還原糖含量的變化

醬油在發酵過程中淀粉質原料會被分解成還原糖，不僅有助于醬油生色，還可被酵母利用生成醇類、酸類、酯類等香氣成分，且還原糖含量與醬油風味的形成密切相關，對醬油的色、香、味等都有較大影響，是醬油釀造過程中的一項重要參數[21]。

由圖2可知，醬油在整個發酵過程中還原糖呈先升后降的趨勢，發酵初期，可能是由于淀粉酶和糖化酶的作用，還原糖含量快速增加，此時還原糖的生成速率遠遠大于其消耗速率；還原糖含量達到最高的快慢與發酵溫度密切相關，真菌淀粉酶的最適溫度為50～60 ℃，因而發酵溫度較高的低鹽固態和高鹽稀態醬油先達到還原糖含量的最高點，隨后自然發酵醬油還原糖含量也達到最高點，且3種發酵方式還原糖含量最高點由高到低排序為高鹽稀態發酵>低鹽固態發酵>自然發酵；之后可能是由于還原糖被酵母等大耐鹽微生物或美拉德反應消耗，生成醇、酸或色素類物質，使其含量明顯下降，且發酵溫度越高，美拉德反應越迅速，因而自然發酵醬油中還原糖的消耗速率明顯低于其他2種發酵方式[22]，發酵后期，由于總酸含量增加等原因，微生物的活動受到抑制，因而還原糖的下降趨勢變緩，且低鹽固態醬油還原糖含量于發酵80天左右趨于平穩，自然發酵和高鹽稀態發酵醬油于發酵150天左右趨于平穩，發酵結束時3種發酵方式醬油中還原糖含量相差不太明顯，高鹽稀態和自然發酵醬油中還原糖含量略高，且薏仁碎米醬油中的還原糖含量高于傳統發酵醬油。

圖2 醬油在發酵過程中還原糖含量的變化趨勢Fig.2 The change trend of reducing sugar content in soy sauce during fermentation

3.2 發酵過程中氨基酸態氮含量的變化

氨基酸態氮是醬油呈鮮味成分的特征指標，其含量的高低可表示鮮味的程度，也是衡量醬油品質高低的重要指標之一[23]，氨基酸態氮含量越高，蛋白質利用率和氨基酸轉化率越高，醬油的品質越好，醬油越鮮美[24,25]。

由圖3可知，醬油在發酵過程中氨基酸態氮含量呈先快速增加后逐漸平穩的趨勢。醬油中的氨基酸主要來自原料中蛋白質的分解、微生物的合成和菌體自溶等，制醪初期，由于蛋白酶的催化，蛋白質被分解成大量氨基酸、多肽等，使醬油中氨基酸態氮含量顯著上升[26]，且發酵溫度越高其上升速度越快，因而低鹽固態醬油中氨基酸態氮含量上升趨勢表現最為明顯，且在30天左右趨于平穩；高鹽稀態發酵醬油中氨基酸態氮含量也逐漸上升，直至其含量超過低鹽固態發酵醬油，且在發酵90天左右時趨于平穩；自然發酵醬油的氨基酸態氮含量增長最緩慢，但其含量也在不斷積累，且發酵至90天左右時其含量趨于平穩。發酵至180天時氨基酸態氮含量按大小排序為高鹽稀態發酵>低鹽固態發酵>自然發酵，高鹽稀態和低鹽固態薏仁碎米醬油氨基酸態氮含量均高于傳統發酵醬油，且高鹽稀態薏仁碎米醬油中氨基酸態氮含量高達0.86 g/dL，其含量已達到GB/T 18186-2000特級醬油標準，這表明以高鹽稀態發酵方式發酵的薏仁碎米醬油品質最好，蛋白質利用率最高。

圖3 醬油在發酵過程中氨基酸態氮含量的變化趨勢Fig.3 The change trend of amino nitrogen content in soy sauce during fermentation

3.3 發酵過程中全氮含量的變化

醬油中全氮是衡量醬油產品質量優劣的重要特征指標之一，其含量的高低是界定醬油品質等級的重要依據。

圖4 醬油在發酵過程中全氮含量的變化趨勢Fig.4 The change trend of total nitrogen content in soy sauce during fermentation

由圖4可知，醬油在整個發酵過程中全氮呈波動上升的趨勢。存在波動的原因可能是酵母和乳酸菌等微生物的生長及美拉德反應等消耗部分氮源[27]。大部分蛋白酶的最適溫度為50～55 ℃，較高的溫度有利于酶的作用，能加快醬油的發酵速率，而高鹽稀態和低鹽固態發酵醬油的發酵溫度較高，更適宜蛋白酶的作用，使全氮含量迅速增加，發酵約30 天時，全氮含量達到最高值并趨于平穩，且低鹽固態醬油在發酵90天后繼續發酵，其全氮含量也趨于平穩；高鹽稀態醬油中全氮在發酵約90天時含量達到最高，之后趨于平穩；而自然發酵醬油因受外界溫度變化的影響，全氮含量增長速率較為緩慢，但發酵約90天時其含量也趨于平穩。發酵至180 天時，高鹽稀態薏仁碎米與低鹽固態薏仁碎米醬油中的全氮明顯高于傳統發酵醬油，這可能是由于原料中薏仁碎米與麩皮的蛋白質氮含量不同導致的，這表明用蛋白質含量較高的薏仁碎米代替麩皮釀造醬油能明顯提高醬油中的全氮含量，發酵結束時，高鹽稀態薏仁碎米醬油中總氮含量高達1.48 g/dL，參照GB/T 18186-2000，其含量達到“一級”醬油標準。用薏仁碎米代替麩皮釀造醬油有利于提高醬油的品質。

3.4 發酵過程中無鹽固形物含量的變化

醬油中的可溶性無鹽固形物主要包括各種可溶性蛋白質、糊精、胨、肽、氨基酸、糖分、色素等物質，是直接反映醬油品質的重要指標之一，醬油中可溶性無鹽固形物含量越高，表明醬油中的糖類、有機酸、氨基酸等的含量越高，醬油質量越好[28]。

圖5 醬油在發酵中無鹽固形物含量的變化趨勢Fig.5 The change trend of salt-free solids content in soy sauce during fermentation

由圖5可知，醬油在整個發酵過程中無鹽固形物含量呈現先迅速增加后趨于平穩的趨勢，低鹽固態醬油在發酵前期無鹽固形物迅速積累，發酵30天左右時含量達到最高，60天左右時其含量趨于平穩；高鹽稀態醬油在發酵第25天時含量最高，90天左右時趨于平穩；而自然發酵醬油的無鹽固形物在發酵70 天內緩慢積累，發酵至中后期時其含量也趨于平穩。發酵結束時，醬油中可溶性無鹽固形物含量按含量大小排序為低鹽固態發酵>高鹽稀態發酵>自然發酵，薏仁碎米與傳統原料發酵醬油中可溶性固形物含量相差不大，高鹽稀態薏仁碎米醬油中可溶性固形物含量稍高于傳統原料發酵醬油，達到“一級”醬油標準，結果表明：發酵工藝對醬油中可溶性固形物含量具有較大影響，而發酵原料對醬油可溶性固形物含量影響較小。

3.5 發酵過程中總酸含量的動態變化

醬油中總酸包含的有機酸能與相應的醇類發生酯化反應生成具有芳香氣味的各種酯，在一定范圍內能增進醬油風味和賦予醬油醇厚的滋味。

圖6 醬油在發酵過程中總酸含量的變化趨勢Fig.6 The change trend of total acid content in soy sauce during fermentation

由圖6可知，總酸含量在醬油整個發酵過程中隨發酵時間的延長而不斷積累，后期趨于平緩，引起總酸變化的原因可能是發酵過程中氨基酸的溶出及生成、游離脂肪酸的積累、原料水解為含羧基端的多肽、碳水化合物被微生物利用生成有機酸等[29]。低鹽固態發酵醬油的總酸增長速率最快，其次是高鹽稀態醬油，且分別在發酵90天和130天左右時其含量趨于平穩，而自然發酵醬油的總酸含量上升速率則較為緩慢。發酵結束時，3種發酵方式發酵的醬油中總酸含量按大小排序為低鹽固態發酵>高鹽稀態發酵>自然發酵，且高鹽稀態薏仁碎米醬油中總酸含量高于傳統發酵醬油，而薏仁碎米低鹽固態和自然發酵醬油中總酸含量與傳統發酵方式醬油相差不大。結果表明：用薏仁碎米代替麩皮釀造醬油對醬油的總酸含量影響不大，且以低鹽固態發酵方式釀造的薏仁碎米醬油中總酸含量最高，但是否能增進醬油的風味，需進一步對醬油中有機酸組分進行探討。

3.6 醬油中有機酸含量的變化

3.6.1 分離條件的確定

色譜柱SB-Aq適用于增加難以分離的酸性、堿性和極性化合物的保留值，具有保留作用強、重復性和穩定性高及能有效防止固定相塌陷等優點。因而選用色譜柱SB-Aq進行分離的效果較好。

磷酸鹽緩沖液體系適用于有機酸的分離測定，經研究各待測有機酸的最大吸收峰值，確定適宜的檢測波長，且分析流動相中磷酸鹽的種類、濃度和流動相的pH值、峰形改性劑甲醇的含量對分離效果的影響，同時試驗了其他影響因素如流速、柱溫對有機酸分離效果的影響，最終得到了相對優化的分離條件。色譜柱：Zorbax SB-Aq (4.6 mm i.d.×250 mm，0.5 μm)；流動相：96% pH值為2.0的0.02 mol/L KH2PO4和4%甲醇；進樣量為10 μL；紫外檢測波長：210 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃。

在最終優化的分離條件下，待測的9種有機酸均能達到完全分離。將9種有機酸混合標準溶液進樣，進樣量為10 μL，在優化條件下最終得到分離的9種有機酸的標準色譜圖，9種有機酸標準品濃度及色譜保留時間見表1。

表1 9種有機酸標準品的濃度及色譜保留時間Table 1 Concentration and retention time of 9 organic acid standard samples

3.6.2 有機酸標準曲線的回歸方程

9種有機酸標準品的標準曲線回歸方程見表2。

表2 9種有機酸標準曲線的回歸方程Table 2 Regression equations of 9 organic acid standard curves

由表2可知，此方法所得各有機酸回歸方程的相關性好，定量精確，靈敏度高，重現性好，回收率高，適合做醬油發酵液中的有機酸分析。

有機酸是醬油的重要風味成分之一，其酸味和特殊風味在一定程度上影響醬油的整體口感和風味，具有呈味、助香和緩沖平衡等作用[30-32]。有機酸含量的高低及各成分的比例構成對醬油的品質和風味具有較大影響。

制醪初期，醬油中有機酸以原料帶入為主，由于醬油發酵過程中微生物的新陳代謝，乳酸和乙酸含量迅速上升，最終醬油中有機酸均以乳酸為主，乳酸能賦予醬油綿長圓潤的口感，使醬油的風味更為柔和，乳酸含量越高，醬油的品質和風味越好。

表3 不同發酵方式的薏仁碎米和 傳統發酵醬油中有機酸的含量Table 3 Content of organic acids in cracked coix seed and traditional fermented soy sauce by different fermentation methods

由表3可知，以高鹽稀態和自然發酵方式釀造的醬油中有機酸總含量明顯高于以低鹽固態方式發酵的醬油，且薏仁碎米醬油中有機酸含量高于以豆粕麩皮為原料的傳統醬油。乳酸和乙酸是醬油中主要的有機酸，高鹽稀態薏仁碎米醬油中乳酸含量最高，其含量高達0.802 g/dL，因而對醬油風味的影響最大；3種發酵工藝中，高鹽稀態醬油的乙酸含量高于其他2種發酵醬油，且其含量均高于傳統發酵醬油；酒石酸和草酸也是醬油中重要的呈味有機酸，薏仁碎米發酵醬油中草酸和酒石酸含量均明顯高于傳統發酵醬油。結果表明：用薏仁碎米代替麩皮釀造醬油能較大程度提高醬油中各有機酸含量，且高鹽稀態發酵方式發酵的醬油中有機酸總量最高，以乳酸含量最為突出，能較大程度提高醬油的品質和風味。

4 結論

薏仁米作為一種藥食同源的優質禾谷物，具有豐富的營養價值，但其加工過程中產生的薏仁碎米會造成薏仁資源的浪費，以薏仁碎米代替麩皮釀造醬油既能對薏仁碎米進行充分利用，又能賦予醬油薏仁米特有的保健功能和特殊的風味。為探討以薏仁碎米代替麩皮作為原料釀造醬油是否可行和不同發酵方式對醬油品質的影響，通過分析高鹽稀態、低鹽固態及自然發酵3種發酵工藝對醬油發酵過程中總酸、全氮、氨基酸態氮、還原糖、無鹽固形物及有機酸含量的影響。得出3種發酵工藝中，高鹽稀態發酵醬油中氨基酸態氮、全氮、無鹽固形物和總酸含量均高于自然發酵醬油，低鹽固態發酵醬油中各理化指標含量發酵約90天趨于平穩，繼續發酵至180天時其含量與高鹽稀態醬油相比仍相差不大，表明在相同發酵周期內，高鹽稀態和低鹽固態發酵醬油中各項指標含量差異較小，但明顯高于自然發酵醬油；以3種發酵方式發酵的傳統豆粕麩皮醬油中有機酸含量無明顯差異，而低鹽固態薏仁碎米醬油中以乳酸為代表的有機酸含量則明顯低于高鹽稀態醬油和自然發酵醬油，不利于醬油的整體風味和口感，表明以薏仁碎米為原料采用不同發酵方式發酵的醬油風味差異較大，且高鹽稀態薏仁碎米醬油的品質和風味最好；高鹽稀態薏仁碎米醬油中總酸、氨基酸態氮、全氮、無鹽固形物和有機酸中乳酸、乙酸和酒石酸含量均高于傳統豆粕麩皮醬油，其中全氮、氨基酸態氮及可溶性無鹽固形物含量分別為1.29，0.75，11.95 g/dL，達到GB/T 18186-2000一級醬油標準。試驗結果表明：用薏仁碎米代替麩皮釀造醬油是可行的，且以高鹽稀態發酵方式釀造的薏仁碎米醬油能較大提高醬油的品質和風味。