基于PCR-DGGE方法分析泡菜中乳酸菌群落結構

燕平梅，宋敏麗，喬宏萍，趙文婧，陳燕飛

(1.太原師范學院 生物系，太原 030619; 2.土壤消毒活化綠色產業技術創新戰略聯盟，太原 030619)

我國地大物博，蔬菜年產量數億噸，居于世界前列。但由于生產落后，缺少貯藏手段，使得每年的蔬菜損失重大。泡菜在我國具有悠久的歷史，泡菜的存在大大降低了蔬菜的浪費，由于其加工簡單，味道鮮美，富含維生素、纖維素和蛋白質等營養物質[1]，具有清腸、抗癌、抗肥胖等功能[2,3]，固而受到人們的青睞。

泡菜是我國傳統的蔬菜發酵食品，主要進行乳酸發酵。Jung S L等的研究表明乳酸菌是泡菜發酵的主要微生物[4,5]。在發酵過程中以乳酸菌等有益微生物群體穩定且占絕對優勢，幾乎不發生污染，發酵產物甚至可以不用消毒。泡菜中的乳酸菌對泡菜的色、香、味、品質至關重要[6]，這主要是由于在泡菜的制作過程中，乳酸菌的代謝產物和所處的低氧環境抑制了有害微生物的生長。首先乳酸菌產酸和一些呈味物質，其次乳酸菌不能分解纖維素，這使得泡菜有良好的外觀[7]。總而言之，乳酸菌的種類和特性與泡菜的風味和品質緊密相關。我國傳統的自然發酵很難滿足人們對泡菜的需求，而且發酵時間長，會使亞硝酸鹽這種致癌物質大量積累，危害人們的健康。因此，將泡菜投入到工業化生產是十分必要的。韓國泡菜、日式泡菜工業化生產已經達到了成熟階段，而中國如四川泡菜的工業化生產仍處于起步階段，還有待進一步發展。本實驗利用PCR-DGGE技術可以分離出兩種市售泡菜中不同種的乳酸菌，不僅了解泡菜中乳酸菌的種類和分布，而且為泡菜工業化生產篩選和培育優良乳酸菌種奠定了基礎。

張慶芳等人的研究表明乳酸菌能夠降解亞硝酸[8]。這是由于乳酸菌產酸，使得發酵體系中的pH升高，可以抑制其中有害微生物的生長，如能夠產生硝酸還原酶的微生物，它們可以將泡菜中富集的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。同時在H+的作用 下，將NO2-還原成NO-，降低了亞硝酸鹽的含量。亞硝酸鹽能與胺類物質生成亞硝胺，亞硝胺攝入會對人體造成危害，是一種毒性很強的致癌物質；另外亞硝酸鹽易引起高鐵血紅蛋白癥，使生物組織缺氧、血管擴張、血壓降低[9]。如果能夠將降解亞硝酸鹽能力強的乳酸菌株應用于泡菜發酵，這對我國泡菜的生產及推廣具有重要的意義。

自1993年 Muyzer等將變性梯度凝膠電泳技術引入到微生物生態學研究以來，DGGE 已被廣泛應用到各種各樣的生態系統中微生物群落結構分析[10]。由于自然界中只有極其少的微生物能夠通過培養法培養[11]，用傳統的分離培養方法研究泡菜中微生物種群構成易造成微生物多樣性丟失。梁新樂等人的研究表明PCR-DGGE是研究傳統發酵食品中微生物組成的可行性方法[12]。因此，本實驗采用PCR-DGGE技術來更加全面地反映泡菜中乳酸菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 樣品

市售白菜泡菜(青島松源食品有限公司)，用P1表示；泡酸菜(四川廣樂食品有限公司)，用P2表示。

1.2 儀器與設備

TC-96/G/H(b)B Life Touch基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；電泳儀、凝膠成像系統DcodeTMBio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜鹵亞硝酸鹽及食鹽濃度的測定

泡菜鹵食鹽濃度測定方法采用硝酸銀滴定法。亞硝酸鹽測定方法按GB/T 5009.33-1996的方法。

1.3.2 泡菜鹵中微生物總DNA的提取及16S rDNA V7-V8片段的PCR

使用細菌基因組DNA提取試劑泡菜中細菌的DNA。

16S rDNA V7-V8片段的引物分別為：

WBAC1:CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCAC-CGCG；WBAC2:GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA。

PCR反應體系中引物1 μL(10 μL)，模板DNA1.5 μL，Mix 12.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察。

1.3.3 變性劑梯度凝膠電泳分離16S rDNA基因(DGGE)

變性梯度凝膠的配方見表1。

表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 The formula of denaturing gradient gel

DGGE電泳后，將可看到的電泳帶切割回收，作為模板進行PCR反應，將擴增后的16S rDNA V7-V8片段與pGM-T Vector連接，轉化感受態細胞。檢測陽性克隆，進行基因序列測定。

1.3.4 DGGE條帶結構多樣性分析

DGGE圖譜上每個條帶的位置和相對光密度值被該Quantity One軟件自動分析確定。數據的標準化處理用電泳條帶的光密度峰值除以該條帶所在泳道所有條帶光密度峰值的平均值。DGGE泳道內的電泳條帶數量用以計算物種豐富度(Species Richness，用R表示)，運用電泳條帶相對密度值計算物種均勻度(Species Evenness，用E表示)及物種多樣性(Shannon，用H表示)。3種生態指數的計算公式為：

H=-∑(ni/N)In(ni/N)；

E=H/InS；

R=S-1/InN。

式中：ni為單一條帶的峰面積，N為某一泳道的所有峰面積，S為某一泳道的總條帶數。

1.3.5 系統發育分析方法

將得到的16S rDNA V7-V8目的片段序列提交到GenBank中進行BLAST比對，選出與目的片段相似度高的序列，利用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining法構建16S rDNA的系統發育樹，進行系統發育分析。

2 結果及分析

2.1 泡菜中食鹽濃度和亞硝酸鹽的含量

采用滴定方法測定兩種泡菜的氯化鈉濃度，結果見表2。泡菜P1的食鹽濃度是P2的2.11倍。

采用分光光度法測定兩種泡菜的亞硝酸鹽含量，結果見表2。泡菜P1的亞硝酸含量是P2的2.35倍。但是兩種泡菜中亞硝酸鹽含量遠低于我國GB 2762—2012中規定的亞硝酸鹽限量指標(20 mg/kg)。

表2 不同泡菜中食鹽含量Table 2 The salt content in different pickles

2.2 PCR-DGGE實驗結果

2.2.1 泡菜中16S rDNA V7-V8片段的PCR擴增

將從泡菜汁中提取出的DNA用25 μL的反應體系進行PCR擴增，所用的引物為WBAC1和WBAC2，再將擴增出的PCR產物進行電泳分析，結果見圖1。

圖1 16S rDNA片段的PCR擴增 瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 The agarose gel electrophoresis map of 16S rDNA fragment by PCR amplification

由圖1可知，16S rDNA V7-V8區的擴增片段的大小在370～380 bp左右。擴增條帶清晰、無雜帶，能夠進行DGGE實驗。

2.2.2 泡菜16S rDNA V7-V8基因的DGGE分析

DGGE電泳結果中，有不同遷移率和明亮程度不同的電泳條帶，每一全條帶代表不同種屬的乳酸菌，電泳條帶亮度程度反映了乳酸菌的相對數量，條帶越亮，表示該種屬細菌的相對數量越多。

圖2 泡菜中乳酸菌16S rDNA片段的DGGE圖譜Fig.2 DGGE map of 16S rDNA fragment of Lactobacillus in pickles

由圖2可知，本次實驗共檢測出了10個條帶。泡菜P1檢測到3條帶A、B、C，即有3種乳酸菌；泡菜P2檢測到7個條帶D、E、F、G、H、I、J，即有7種乳酸菌。說明泡菜P2中的乳酸菌種類較泡菜P1中的豐富。A與H位置相同，為同一種乳酸菌。P1中A和C的亮度最亮，說明乳酸菌A和C是泡菜P1乳酸菌中的優勢種；P2中J的亮度最亮，說明乳酸菌J是泡菜P2乳酸菌中的優勢種。可見，同一種乳酸菌在不同的泡菜中所處的地位是不同的。

2.2.3 泡菜中乳酸菌群落特征

通過Quantity One軟件分析DGGE電泳圖譜，以電泳條帶數量計算物種豐富度，以電泳帶相對密度值計算乳酸菌均勻度及多樣性。多樣性指數、均勻度和豐富度3種生態指數是衡量群落的種類數、個體總數以及各種群均勻程度的量化指標，反映群落結構特征的量度值、群落結構的特征及差異性。泡菜P2中乳酸菌多樣性指數和豐富度指數顯著高于泡菜P1，均勻度指數無顯著差異，見表3。

表3 泡菜微生物乳酸菌群落結構特征Table 3 The community structure of characteristics of lactic acid bacteria in pickles

3 討論

本實驗以市售的兩種泡菜為研究對象，測定不同泡菜的食鹽濃度及亞硝酸鹽含量，運用PCR-DGGE技術分析了這兩種泡菜中乳酸菌的多樣性，多方面結合比較。泡菜P1中的食鹽濃度和亞硝酸鹽含量都高于泡菜P2，而泡菜P1中的乳酸菌豐富度低，這是由于高鹽導致乳酸菌受到抑制，而乳酸菌又能夠降解亞硝酸鹽。

食鹽含量對微生物群落結構影響很大[13]。泡菜微生物群落成員對食鹽濃度的耐受性不同。通常高濃度食鹽(10%～16%)有利于酵母菌生長，而低濃度食鹽(5%～8%)則有利于乳酸菌生長[14]。在低溫下，6%的食鹽濃度比8%的能更好地促進乳酸菌生長。

自從PCR-DGGE技術應用于研究微生物物種的多樣性，對發酵食品中微生物的物種多樣性研究甚多。對其中乳酸菌的多樣性研究也頗多，如蔣厚陽運用PCR-DGGE對西藏傳統發酵乳制品中的乳酸菌多樣性進行了研究[15]。相比之下，本實驗的不足：沒有對DGGE的條帶進行測序，只對DGGE的圖譜進行了分析，利用Quantity One軟件分析了PCR-DGGE的圖譜，計算出了反映乳酸菌多樣性的指數。