應用高通量測序技術分析成品甜芽菜微生物多樣性

白光劍，鄒偉，李豪，張靜

(四川理工學院 生物工程學院，四川 宜賓 644000)

芽菜是一種風味獨特的傳統醬腌菜，在我國川南地區較為盛行[1]。其生產流程包括：第一步，將新鮮的芥菜切成細條狀并曬干；第二步，將曬干的芥菜條清洗、加鹽混勻并放入容器中發酵1周左右，然后將鹽去掉，繼續曬干芥菜條；第三步，將芥菜放入桶內，同時添加胡椒、茴香、姜、蔥等調料，室溫密封發酵6～12個月即成。芽菜可分為甜芽菜和咸芽菜兩種。第三步發酵前加入紅糖后得到的芽菜屬于甜芽菜，不加紅糖發酵得到的是咸芽菜。目前宜賓芽菜主要通過自然發酵生產，這一過程中大量環境微生物為宜賓芽菜獨特的風味物質形成起著關鍵作用。國內對芽菜的研究主要集中在芽菜中重要微生物的分離篩選和芽菜風味物質的檢測[2-6]。本文主要通過高通量測序技術研究成品芽菜中微生物群落多樣性，確定甜芽菜中重要的微生物，為后續工作中加強宜賓芽菜微生物資源的開發提供一定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗樣品取自自貢市某農貿市場，所有分析樣品均為無菌采樣，收集3組樣品后立即用4～6 ℃的便攜式冷藏箱2 h內運到實驗室，貯存在冰箱待用。

1.2 樣品DNA提取與PCR擴增

樣品DNA的提取采用土壤基因組DNA快速提取試劑盒升級版50次(離心柱型)，購于BioTeke公司，然后用核酸蛋白儀檢測DNA 的濃度和純度。真菌18S V5-V7區域擴增通用引物：SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)、1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)。真菌 PCR(50 μL)擴增體系：dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer(Mg2+plus)5 μL，正向和反向引物各1 μL，模板 DNA 5 μL，Ex Taq 酶 0.25 μL，ddH2O補足至50 μL，混合均勻。真菌 PCR擴增程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 45 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，反應共進行30個循環；最后72 ℃ 8 min。細菌 16S rRNA V4 擴增通用引物：16S 338F(5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′)、16S 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。細菌 PCR(50 μL)擴增體系：dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer(Mg2+plus) 5 μL，正向和反向引物各 1 μL，模板 DNA 5 μL，Ex Taq 酶 0.25 μL，ddH2O補足至50 μL，充分混勻。細菌PCR擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反應共進行30個循環；最后72 ℃ 5 min。根據 PCR 擴增圖譜，擴增后的條帶比較清晰明顯且條帶位置一致，背景干凈，DNA 濃度達到了擴增要求，可直接用于后續分析。委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3 測序數據優化處理

保證分析結果的準確性，運用Qiime進行序列過濾[7]，數據過濾標準為：去除5′端引物錯配堿基數>1的序列；去除含有N(模糊堿基)的序列；去除含有連續相同堿基數>8的序列；去除長度≤150 bp的序列；去除嵌合體序列。運用 Mothur軟件中的Uchime方法去除嵌合體序列，得到最終用于后續分析的優質序列[8]。

1.4 OTU聚類分析及注釋

聚類分析主要通過在Qiime中調用Uclust的方法完成，OUT注釋主要通過在Qiime中調用Blast的方法對序列數據庫進行比對，OUT精簡的方法參考文獻[9]。

1.5 多樣性及群落結構分析

種群豐富度指數Chao指數和ACE指數，群落多樣性指數Shannon指數和Simpson指數，主要通過軟件Mothur中的summary.single命令計算獲得。不同分類水平上(門、屬)的物種豐度表和豐度圖主要通過Qiime軟件完成。

1.6 稀釋曲線制備

稀釋性曲線(rarefaction curve)采用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建。使用97%相似度的OTU利用mothur做rarefaction分析，利用R語言工具制作稀釋性曲線。

2 結果與分析

2.1 序列長度分布

測序結果顯示：本研究3個芽菜樣品所測得的細菌Reads共71140條，分布在401～460 bp長度范圍內，平均長度為447.5 bp，長度在441～460 bp范圍內占89.38%，有63854條；3個樣品所測得的真菌Reads共60900條，分布在261～420 bp長度范圍內，平均長度為402.26 bp，長度在401～420 bp范圍內占93.18%，有56746條。從序列長度的分布來看，與細菌16S rDNA-V4區序列大致吻合。

2.2 實驗樣品中微生物群落多樣性結果

利用高通量測序技術，經序列過濾和去除嵌合體序列，3個芽菜樣品最終得到用于后續數據分析的細菌有效序列65797條，有效率為92.49%；真菌的有效序列54750，有效率為89.90%。本次研究3個樣品共產生細菌OTU數609個，每個樣品203個，細菌群落分布在7個門、15個綱、31個目、63個科、114個屬，見表1。3個樣品共產生真菌OTU數109個，樣品1和樣品3各36個，樣品2 OTU數37個，其群落分布在7個門、16個綱、24個目、30個科、28個屬中，見表2。

表1 細菌16S rDNA序列豐富度及多樣性Table 1 Richness and diversity of bacterial 16S rDNA sequence

表2 真菌18S rDNA序列豐富度及多樣性Table 2 Richness and diversity of fungal 18S rDNA sequence

2.3 多樣性指數分析

群落生態學中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統計學分析指數估計環境群落的物種豐度和多樣性。有用于計算菌群豐度(community richness)的指數Chao、ACE，用于計算菌群多樣性(community diversity)的指數Simpson、Shannon，以及代表測序深度的指數Coverage。其中Chao或ACE指數越大，說明群落豐富度越高；Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低；Coverage值越高，則樣本中序列被測出的概率越高。

由表1和表2可知，細菌的Chao和ACE指數均大于真菌，說明成品甜芽菜中細菌群落豐富度大于真菌群落；從Simpson和Shannon指數來看，細菌群落的多樣性也高于真菌；兩者Coverage指數都非常接近1，表明本次測序結果能代表樣本中微生物的真實情況。

2.4 微生物多樣性稀釋性曲線

綜合數據和稀釋曲線分析來看(見圖1)，在較少的測序數范圍內，真菌和細菌均有大量的OTU產生，細菌較真菌有更多的OTU。各樣本所代表的曲線斜率，在測序數5000左右驟然下降，真菌的稀釋曲線有少量新的OTU產生，細菌OTU變化很小，隨著測序深度增加，真菌和細菌的稀釋曲線斜率趨于平穩。說明測序數據量合理，能有效地反映芽菜中微生物的豐富度和多樣性。

圖1 芽菜樣品中微生物變化稀釋曲線 Fig.1 Microbial variation dilution curves of samples

注：A為細菌變化稀釋曲線圖;B為真菌變化稀釋曲線。

2.5 微生物豐度分析

由于通常測序分析，芽菜樣品能檢測出大量微生物種類，但許多物種含量稀少，不能與含量多的物種明顯體現在同一個圖中，所以將物種的豐度大于1%作為劃分依據，以相對豐度為縱坐標，繪制柱形圖。從細菌門的分類水平來看，3個樣品所得結果基本相同，共檢測出7個細菌門，分別是放線菌門 (Actinobacteria)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、藍細菌(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門 (Proteobacteria)、無壁菌門(Tenericutes)。其中優勢細菌有變形菌門(49.1%)、厚壁菌門(40.9%)、放線菌門(5.1%)、擬桿菌門(2.6%)、藍細菌(2.6%)(所得豐度值百分比取3個樣品的平均值，下同)，其他細菌菌門豐度值均小于1%，(見圖2A)。從細菌屬的分類水平來看，共檢測出114個屬，按其豐度值排序，分別是鹽單胞菌屬(Halomonas，27.2%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，11.9%)、腸球菌屬(Enterococcus，6.8%)、Lactococcus，96.2%)、假單胞菌屬(Pseudomonas，5%)、Enterobacteriaceae_unclassified(4.8%)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium，4.5%)、歐文氏菌屬(Erwinia，2.6%)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium_1，2.5%)、魏斯氏菌屬(Weissella，2.2%)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus，2.2%)、Cyanobacteria_norank(2.1%)、拉恩菌屬(Rahnella，1.4%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，1.4%)、Alkaliphilus(1.4%)、Acinetobacter(1.0%)，其他菌群豐度小于1%，占總菌群豐度的15.2%(見圖2B)。

圖2 成品甜芽菜細菌群落門(A)和屬(B)水平相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria in the finished product of sweet sprouts at phylum(A)and genus(B)levels

從真菌門的分類水平來看，3個樣品共檢測出6個門的真菌：Arthropoda、子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、Ciliophora、Phragmoplastophyta、結合菌門(Zygomycota)，其中占優勢的門是Ascomycota(63.7%)，Basidiomycota(36.1%)，其他 4個菌門豐度所占百分比之和約占0.2%(見圖3A)。從真菌屬的分類水平來看，共檢測到28個屬，按其豐度排序分別是Saccharomycetales_unclassified(28.5%)，樣品2的略高于其他兩個樣品，德巴利酵母屬(Debaryomyces，15.8%)，Filobasidiaceae_norank(14.1%)，Cladosporium(7.1%)，Itersonilia(6.6%)，Incertae_Sedis_Incertae_sedis(6.1%)，Leucosporidiales_norank(5.3%)，Pleosporaceae_unclassified(5.2%)，核盤菌屬(Sclerotinia，5.0%)，Tremellales_norank(3.2%)，其他菌群豐度均小于1%，占總菌群豐度的3.1%(見圖3B)。

圖3 成品甜芽菜真菌群落門(A)和屬(B)水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of fungi in the finished product of sweet sprouts at phylum(A)and genus(B)levels

3 討論

本文采用Miseq高通量測序技術對成品甜芽菜中細菌和真菌多樣性進行研究。對細菌的測序顯示，共得到65797條有效序列，聚類分析共產生609個OTU，3個樣品較為平均，各有203個，分屬7個門114個屬內，其中從門水平來看Proteobacteria(49.1%)，Firmicute(40.9%)具有較大優勢；從屬水平來看，鹽單胞菌屬(Halomonas，27.2%)的豐度最高，芽孢桿菌屬(Bacillus，11.9%)次之。與前期報道芽菜發酵過程細菌多樣性相比[10]，Bacillus和Pseudomonas均為優勢菌株，但成品芽菜中的Halomonas，Enterococcus，Lactococcus在發酵過程中優勢不明顯。發酵過程中的優勢菌株如Flavobacteriaceae，Sphingobacterium，Sphingomonas，Acidovorax，Chromohalobacter，Arthrobacter在成品甜芽菜中優勢并不明顯。真菌的測序共得到有效序列54750條，聚類分析共產生109個OTU，分屬7個門28個屬。從門水平來看，Ascomycota(63.7%)，Basidiomycota(36.1%)具有絕對優勢，其他真菌門豐度較小。從屬水平結果看Saccharomycetales_unclassified(28.5%)，Debaryomyces(15.8%)，Filobasidiaceae_norank(14.1%)3個菌屬較為優勢。與芽菜發酵過程相比[11]，發酵150天時Debaryomyces(62%)相比優勢下降。可以看出即便是與發酵末期相比，芽菜中的細菌和真菌群落結構和豐度都發生了不小的變化。

目前，已有學者對芽菜發酵過程以及成品芽菜的風味物質成分進行了系統研究[12]。成品甜芽菜的主要風味成分為丁酸、E-11-棕櫚酸乙酯、2,3-丁二醇、2,6,10-三甲基十四烷、芥子酸、1-十八烷烯、1H-吲哚-3-乙腈。解析芽菜中微生物群落組成與其風味物質產生之間的關系不僅有助于理解芽菜的風味物質形成機制，同時也有助于進一步控制芽菜質量，但相關研究較少，將是未來研究的熱點。