超聲波-微波輔助溶劑提取胡椒鮮 果油樹脂的工藝研究

吳桂蘋,賈雯,谷風林*,譚樂和,張衛明,張鋒倫

(1.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；2.國家重要熱帶作物工程技術 研究中心，海南 萬寧 571533；3.海南省熱帶香料飲料作物工程技術研究中心， 海南 萬寧 571533；4.南京野生植物綜合利用研究院，南京 211100)

胡椒(PipernigrumL.)，又名黑川、白川、浮椒及王椒等，為胡椒科胡椒屬多年生常綠藤本植物，是世界上重要的調味香料[1]。世界上胡椒主要分布在南美洲的中部和北部，主產國是印度、印度尼西亞、越南等，我國胡椒種植面積和產量分別居世界第6 位和第5 位。海南省是我國胡椒的主產區，種植面積和產量均占全國的90%以上，種植面積約33萬畝，產量約3.8萬噸，年均產值20 多億元[2]。海南省已有70多年的胡椒種植和加工歷史，但90%以上的胡椒鮮果被加工成白胡椒粒、白胡椒粉等初產品，極少部分被加工成黑胡椒，而白胡椒、黑胡椒等初產品的傳統加工一般需要3～7天才能將其水分含量曬干至12%以下。胡椒鮮果中水分含量約70%～80%，含有少量的多酚類物質，具有較強的抗氧化活性[3]。胡椒油樹脂是采用溶劑提取或超臨界流體等技術將胡椒中的風味活性物質提取出來的混合膏狀物，其主要成分是胡椒堿，其次是β-石竹烯、檸檬烯等風味物質[4]，已被列入食品添加劑，可作為肉類食品、調味產品、飲料和烈性酒等的調配香料[5]。國內外學者研究報道了溶劑提取[6-8]、超聲波法[9]、微波提取法[10，11]、超臨界流體萃取法[12]等不同方法提取胡椒油樹脂的得率，并對胡椒油樹脂中的化學成分進行了分析鑒定[13]。吳桂蘋等研究報道了不同提取方法對黑胡椒油樹脂得率及其胡椒堿含量的影響，發現超聲波-微波協同萃取所得黑胡椒油樹脂得率最高，Kelly等發現胡椒油樹脂具有較強的抗菌活性[14，15]。但目前尚未見直接以胡椒鮮果為原料提取胡椒油樹脂的研究報道，因此，本實驗以胡椒鮮果為原料，采用超聲波-微波協同萃取法提取胡椒油樹脂，并對其加工工藝進行響應面優化，為胡椒鮮果的直接利用提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡椒鮮果：由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所提供，為印尼大葉種胡椒的果實。

無水乙醇(分析純)：西隴化工股份有限公司；甲醇(色譜純)：德國默克公司；胡椒堿(色譜純，純度>98.00%)： 北京世紀奧科生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

CW-2000超聲波-微波協同萃取儀 上海新拓微波溶樣測試技術有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；HW.SY11型電熱恒溫水浴鍋 常州恒隆儀器有限公司；MF15磨漿機 廣州雷邁機械設備有限公司；HDM-100電熱套 常州國華電器有限公司；AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理

將胡椒鮮果粒清洗干凈，用磨漿機將其磨成漿，保存至4 ℃冰箱中待測。

1.3.2 單因素及響應面試驗

單因素及響應面試驗均在超聲波-微波協同萃取儀中進行，其中，超聲波選擇開啟，微波功率為300 W，提取溫度為55 ℃，選取料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45)、乙醇濃度(60%、70%、80%、90%、100%)、提取時間(10，15，20，25，30 min)3個因素，以提取的胡椒油樹脂得率與油樹脂中的胡椒堿含量作為考察指標進行單因素試驗。根據單因素試驗結果，利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進行響應面試驗設計，以胡椒油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量為響應值，選取提取料液比、乙醇濃度、提取時間3個因素，采取三因素三水平響應曲面分析法進行提取工藝優化，試驗因素水平值及編碼值見表1。

表1 試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of test

1.3.3 胡椒堿含量測定

用高效液相色譜儀檢測上清液中的胡椒堿含量，儀器檢測條件參考國家標準GB 17582-2009，即以甲醇和水為流動相，體積比為77∶23，流速為1.0 mL/min，檢測波長為343 nm，進樣量為10 μL，外標法定量。即準確稱取胡椒堿標準品0.0013 g，加入95%乙醇溶解后定容至10 mL棕色容量瓶中，取1.0 mL該溶液配制25 mL工作液，并用工作液配制不同濃度的標準溶液，過0.45 μm有機膜，用高效液相色譜儀檢測。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制胡椒堿標準曲線，通過線性擬合得到回歸方程：y=113.51x-47.69，相關系數為0.9963。

1.3.4 胡椒油樹脂得率計算

1.4 數據分析

試驗數據用Excel 2010、Origin 9.0、SPSS Statistics 20、Design-Expert 8.0.6 Trial軟件及儀器自帶軟件處理，平均數之間的比較采用方差分析中的LSD與Duncan多重比較對比分析，差異顯著性水平P<0.05和P<0.01。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對胡椒油樹脂得率及油樹脂中胡椒堿含量的影響

圖1 料液比對胡椒油樹脂得率及油樹脂 中胡椒堿含量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由圖1 可知，隨著料液比的增加，胡椒油樹脂的得率呈先緩慢增加后逐漸降低的趨勢。在料液比為1∶35 (g/mL)時，胡椒油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量都達到最高，分別為13.2%和34.212%，而且在料液比為1∶30～1∶35 (g/mL)之間，胡椒油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量均有明顯的變化趨勢，因此，選擇料液比的范圍為1∶30～1∶40 (g/mL)。

2.1.2 乙醇濃度對胡椒油樹脂得率及油樹脂中胡椒堿含量的影響

圖2 乙醇濃度對胡椒油樹脂得率及油樹脂 中胡椒堿含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由圖2可知，乙醇濃度在60%～70%之間油樹脂得率呈現逐漸上升趨勢，乙醇濃度達到70%后油樹脂得率逐漸降低，在乙醇濃度70%時達到最大值。油樹脂中胡椒堿含量在60%～90%之間慢慢趨于穩定，在乙醇濃度為100%時含量最高。由于此次試驗以胡椒油樹脂的得率為主要考察指標，所以綜合考慮，乙醇濃度的選擇范圍為60%～80%。

2.1.3 提取時間對胡椒油樹脂得率及油樹脂中胡椒堿含量的影響

圖3 提取時間對胡椒油樹脂得率及油樹脂 中胡椒堿含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由圖3可知，油樹脂得率與油樹脂中胡椒堿含量都在提取時間為15 min時達到最高，分別為16.75%和23.262%，之后逐漸下降，且胡椒堿的含量慢慢趨于穩定。在提取時間為10～20 min左右時，油樹脂得率與油樹脂中胡椒堿含量均比較高，保持了一個良好的趨勢。所以，選擇提取時間的范圍為10～20 min。

2.2 響應面試驗

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

在單因素試驗的基礎上，選取料液比、乙醇濃度、提取時間3個因素為自變量，分別表示為A，B，C。以胡椒油樹脂得率與油樹脂中胡椒堿含量為響應值，采用Box-Behnken設計進行響應面試驗，試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計結果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對表2中的胡椒油樹脂得率進行回歸分析，得到的方差分析結果見表3，參照方差分析對模型的擬合進行了評價。該模型的P值等于0.0046，小于0.05，說明模型擬合性較好，失擬差P值等于0.0646，大于0.05，該模型的失擬性不顯著，得到的多元二次回歸模型為：

油樹脂得率(R1)=16.00+0.050A-0.35B+0.40C+0.15AB-0.35AC+0.050BC-0.47A2-0.48B2-0.27C2。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注：“*”代表差異顯著，P<0.05；“**”代表差異極顯著，P<0.01，下同。

由表3可知，其中B、C、A2和C2均達到顯著(P<0.05)。由料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取時間(C)3個影響因素的F值大小得知其對胡椒油樹脂得率的影響大小排序為：C>B>A。除此之外，決定系數R2=0.8556，表明該方程能夠解釋85.56%的響應值的變化，試驗誤差較小，因此可以用該模型對胡椒鮮果油樹脂的提取進行分析和預測。

同樣利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對表2中胡椒油樹脂中胡椒堿的含量進行回歸分析，得到的方差分析結果見表3，該模型的P值等于0.0282，小于0.05，擬合性顯著，失擬差P值等于0.2067，大于0.05，顯示失擬性不顯著，說明擬合的方程顯著性良好，得到的多元二次回歸模型為：油樹脂中的胡椒堿含量(R2)=23.67+0.14A+1.47B-0.21C-0.00425AB+1.32AC+0.64BC+1.45A2+0.59B2+0.36C2。

由表3可知，B、AC和A2均達到極顯著(P<0.01)，得知3個影響因素對油樹脂中胡椒堿含量的影響大小排序為：B>C>A。同時，通過分析，油樹脂中胡椒堿含量的R2值為0.9184，其校正決定系數的值為0.8134，表明油樹脂中胡椒堿含量的模型擬合度較好，能夠準確預測和分析工藝優化的結果。

2.2.2 各因素間的交互作用

根據回歸方程，利用Design-Expert做因子間的響應面分析圖和等高線圖，因素間的交互作用對胡椒油樹脂得率的影響見圖4。

圖4 因素間的交互作用對胡椒油樹脂得率影響的 響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface map and contour map of the interaction of factors on the yield of pepper oleoresin

根據圖4的響應面圖和等高線圖來分析料液比、乙醇濃度、提取時間對胡椒油樹脂提取得率的影響。料液比和乙醇濃度對胡椒油樹脂得率的影響最大，由其響應圖和等高線可知，在提取時間一定的條件下，隨著料液比的增加，油樹脂的得率先逐漸增加后又急劇下降，此時料液比和乙醇濃度交互作用的響應面圖的中心點處得到的胡椒油樹脂得率最大，為16.174%；料液比和乙醇濃度對胡椒油樹脂得率的影響次之，對胡椒油樹脂得率影響最小的是乙醇濃度和提取時間交互作用，由圖7可知，BC之間的等高線圖形趨于圓形，說明其交互作用對油樹脂得率影響不大。

根據圖5的響應面圖和等高線圖來分析料液比、乙醇濃度、提取時間對胡椒油樹脂提取得率的影響。料液比和提取時間對油樹脂中胡椒堿含量的影響最大，顯示為極顯著，其次是乙醇濃度和提取時間，最后是料液比和乙醇濃度對油樹脂中胡椒堿含量的影響。

圖5 因素間的交互作用對胡椒油樹脂中胡椒堿含量 影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction of factors on the content of piperine in pepper oleoresin

由響應面設計分析可知，胡椒油樹脂得率的最優結果為：料液比1∶30.35 (g/mL)，乙醇濃度75.56%，提取時間20 min，預測的油樹脂得率為15.6014%，油樹脂中胡椒堿含量為25.0798%。油樹脂中胡椒堿含量的最優結果為：料液比1∶30(g/mL)，乙醇濃度76.39%，提取時間20 min，預測的胡椒油樹脂的得率為15.47%，油樹脂中胡椒堿含量為25.408%。由響應面分析得到的油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量的最優組合為：料液比1∶30 (g/mL)，乙醇濃度75.87%，提取時間20 min，這預測結果為油樹脂得率15.52%，油樹脂中胡椒堿含量為25.260%。基于實驗以油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量作為參考指標，選擇可以得到較高油樹脂得率和油樹脂中胡椒堿含量的優化組合，即料液比1∶30 (g/mL)，乙醇濃度75.87%，提取時間20 min。

2.3 驗證試驗

為了檢測和驗證響應面的可行性和有效性，選取最優的提取條件進行3次平行驗證試驗，同時，考慮到實際操作的便利性和局限性，修改最優條件為料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度76%、提取時間20 min，提取的胡椒油樹脂得率為15.70%，油樹脂中胡椒堿含量為25.680%，試驗結果與預測值基本相符，說明曲面響應分析所得的模型是準確可靠的。

3 結論

在前期試驗的基礎上，以胡椒鮮果為原料，經過磨漿處理后，用超聲波-微波輔助溶劑提取胡椒鮮果油樹脂，并用響應面優化了提取工藝，結果顯示：對胡椒鮮果油樹脂得率影響大小順序為提取時間>料液比>乙醇濃度，對油樹脂中胡椒堿含量影響大小順序為乙醇濃度>提取時間>料液比。優化胡椒鮮果油樹脂的提取工藝參數為：料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度76%、提取時間20 min，提取的胡椒油樹脂得率為15.70%，油樹脂中胡椒堿含量為25.680%。超聲波-微波輔助溶劑提取法相對熱回流提取、溶劑提取等方法而言，可將常規提取時間由3～7 h縮短至20 min，在胡椒油樹脂得率上亦能由10%提高到15.7%。因此，胡椒鮮果可直接用于提取胡椒油樹脂，不僅減少了曬干工序，節約了加工周期，而且增加了提取效率，為胡椒鮮果的直接利用和精深加工提供了科學依據。