利魯唑上調EAATs產生對MPTP誘導的帕金森模型小鼠的保護作用

米 超，楊欣欣，齊志鵬，吳鳳迪，崔東日，鄧 宇*

0 引言

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種進行性、病因不明的神經系統退行性疾病，主要發病人群為65歲以上的中老年人，臨床表現以靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩、姿勢步態異常等運動功能癥狀及睡眠障礙、精神障礙、感覺障礙等自主神經功能障礙等癥狀為主要特征[1]。流行病學調查顯示，世界范圍內PD的患病率為0.3%[2]，其中65歲以上年齡段人群占1%～2%，85歲以上年齡段人群患病率增加到3%～5%[3]。有研究顯示，谷氨酸(Glutamate，Glu)的興奮性毒性會加速PD的病理進展。散發性PD患者表現為Glu攝取量降低，而且其降低程度與PD的嚴重程度相關[4]。有研究顯示，Glu的代謝轉運障礙與谷氨酸轉運體(Excitatory amino acid transporters,EAATs)有密切關系，EAATs可清除谷氨酸的堆積，進而發揮保護中樞神經系統免受Glu興奮性毒性的作用[5]。EAAT1和EAAT2主要分布于星形膠質細胞，是Na+/K+依賴的膜蛋白，可促進Glu能突觸周圍的Glu代謝平衡[6]。

利魯唑屬于苯噻唑類化合物，是目前用于治療肌萎縮性側索硬化癥的藥物，已有文獻證實其可抑制Glu從神經末梢釋放，促進Glu與谷氨酸轉運體的結合[7-9]。早在2002年就有利魯唑治療帕金森的隨機對照試驗，但是未見關于利魯唑對PD的神經保護作用的報道[10]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)能夠造成小鼠黑質紋狀體區多巴胺能神經元表達減少，并且出現類似人類的運動功能障礙等現象，是制備PD模型的常用方法[11-12]。本研究主要使用MPTP建立小鼠PD模型后，給予利魯唑干預，觀察小鼠行為學變化情況，以及小鼠紋狀體Glu含量、EAAT1及EAAT2蛋白表達、mRNA表達情況，旨在為臨床應用利魯唑治療帕金森病提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 利魯唑和MPTP購自美國Sigma公司，Glu檢測試劑盒來自南京建成生物科技有限公司，鼠抗EAAT1、EAAT2及β-actin抗體來自Santa Cruz公司，HRP標記山羊抗鼠IgG、Western blot相關試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及電泳液、RIPA buffer裂解液來自上海碧云天生物技術研究所。GDS-8000電泳凝膠成像分析系統(美國UVP公司)，1680酶標儀(美國BIO-RAD公司)，VE-180垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)，EPS-300電泳儀和VE-186轉印電泳槽(上海天能科技有限公司),722型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司),WD-9405B型水平搖床(北京市六一儀器廠)。

1.2 實驗動物及分組 健康SPF級昆明小鼠36只，雌雄各半，體重(30±2)g。由中國醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK2013-0001。本實驗經中國醫科大學倫理委員會批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷，符合衛生部實驗動物管理與使用準則。實驗動物可自由攝食飲水，飼料由中國醫科大學實驗動物中心提供，動物房室溫18～23 ℃，相對濕度為45%～55%。實驗前適應性喂養1周后將動物隨機分為3組，每組12只，雌雄各半，分別為：①對照組，②MPTP組(PD模型組)，③MPTP+利魯唑組(利魯唑治療組)。注射藥品均以0.9% NaCl作為溶劑配制，各組均以腹腔注射的方式給予5 ml/kg的藥品體積。給予對照組腹腔注射生理鹽水，MPTP組和MPTP+利魯唑組小鼠均腹腔注射25 mg/kg MPTP。2 h后，對照組及MPTP組腹腔注射生理鹽水，MPTP+利魯唑組腹腔注射0.7 mg/kg利魯唑。各組小鼠連續處理2周。

1.3 行為學檢測 轉棒實驗用于測試小鼠的運動協調能力。測試前對每只小鼠進行3次適應性轉棒訓練，每次訓練時長為3 min。將小鼠置于電動轉棒上，轉棒直徑為2.5 cm，表面為橡膠質地，轉速為10 r/min，記錄小鼠被置于轉棒上至跌落的時間。每只小鼠重復測定3次，每次間隔30 min，重復測量3次結果，取其平均值。

疲勞儀實驗用于檢測小鼠運動耐力。測試前對每只小鼠進行3次適應性訓練，時間長約 5 min。將小鼠置于疲勞儀轉輪甬道中，通電后小鼠若不運動則會被底部電極刺激，記錄小鼠被置于疲勞儀內致疲勞致不動時的時間(min)及奔跑距離(m)。每只小鼠重復測量3次取平均值。

1.4 小鼠紋狀體組織勻漿內Glu含量的測定 各組取6只小鼠，分離紋狀體，將部分組織制備成10%的組織勻漿，其余組織備用。使用南京建成試劑盒，根據Glu+NAD++H2O→α-oxoglutarate+NADH+NH4+的原理測定Glu含量。

1.5 Real-time RT-PCR檢測小鼠黑質紋狀體組織EAAT1、EAAT2的mRNA表達 根據說明書，使用Trizol法提取總RNA，樣品質量檢測結果260 nm/280 nm應為1.8～2.0。將提取的總RNA按照逆轉錄試劑盒步驟反轉錄為cDNA。最后進行熒光定量PCR，采用的反應體系為20 μl，其中，SYBR 10 μl、上下游引物各 1 μl、RNA free H2O 6 μl、cDNA 模板 2 μl。合成小鼠EAAT1、EAAT2及GAPDH的引物序列如表1所示。反應程序設定為：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火30 s，40個循環。每次試驗均設置GAPDH為內參。用 2-ΔΔCt法計算各組小鼠黑質紋狀體組織EAAT1、EAAT2的mRNA表達的相對表達量。

表1 引物序列

1.6 Western blot檢測小鼠黑質紋狀體組織EAAT1、EAAT2的蛋白表達 各組小鼠取3只，分離紋狀體，加入強效RIPA buffer裂解液(Ripa buffer∶PMSF=100∶1)，在冰上使用組織勻漿破碎機裂解成組織勻漿，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，使用BCA試劑盒測蛋白濃度，并將組織蛋白濃度定量到4 μg/μl。將40 μg蛋白樣品與loading buffer緩沖液混勻，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后電轉至PVDF膜，5%BSA封閉液室溫封閉1 h。4 ℃過夜孵育一抗EAAT1(1∶2 000)，EAAT2(1∶2 000)，β-actin(1∶ 3000)，TBST洗膜，HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL發光顯影，每只小鼠每項指標重復測量3次。使用Image J軟件分析條帶光密度。

2 結果

2.1 利魯唑對MPTP誘導的PD模型小鼠運動能力障礙的影響 如表2所示，與對照組相比，MPTP處理后，小鼠的轉棒潛伏期、耐力潛伏期、跑步距離均縮短(P<0.05)。給予利魯唑干預后，與MPTP組比較，轉棒潛伏期、耐力潛伏期和跑步距離均延長(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。

2.2 利魯唑對MPTP致小鼠紋狀體Glu含量增加的影響 與對照組紋狀體內Glu(23.55±5.21)μmol/g pro相比，MPTP處理組小鼠紋狀體內Glu含量升高，可達(45.62±3.25)μmol/g pro(P<0.01)。給予利魯唑治療后，Glu含量與MPTP誘導的PD模型小鼠相比顯著下降，低至(38.36±8.54)μmol/g pro(P<0.01)。此部分每組6只。

2.3 利魯唑對MPTP致小鼠紋狀體EAAT1、EAAT2表達下降的影響 應用RT-PCR方法，對紋狀體內EAAT1、EAAT2的mRNA表達變化進行觀察。如圖1A所示，與對照組相比，MPTP組的小鼠紋狀體內EAAT1的mRNA水平降低(P<0.01)；與MPTP組相比，利魯唑干預后EAAT1的mRNA水平升高(P<0.01)。如圖1B所示，MPTP組的小鼠紋狀體EAAT2的mRNA水平較對照組降低(P<0.01)，而給予利魯唑治療后，與MPTP組相比，EAAT2的mRNA水平明顯回升(P<0.01)。

2.4 利魯唑對MPTP致小鼠紋狀體EAAT1和EAAT2表達下降的影響 應用Western blot方法，對紋狀體內EAAT1、EAAT2的蛋白水平變化進行觀察。如圖2所示，將檢測到的EAAT1及EAAT2的蛋白條帶進行灰度分析，目的蛋白的灰度水平與相應內參β-actin灰度值用比值表示。如圖2A所示，與對照組相比，MPTP組小鼠的EAAT1蛋白水平顯著降低(P<0.01)。而與MPTP組相比，在利魯唑治療組中，EAAT1蛋白水平顯著回升(P<0.01)。如圖2B所示，MPTP組EAAT2蛋白水平顯著降低(P<0.01)，與MPTP組相比，給予利魯唑治療后，EAAT2水平顯著升高(P<0.01)。

表2 利魯唑對MPTP誘導的PD模型小鼠運動能力的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，* *P<0.01；與MPTP組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組小鼠紋狀體內EAAT1及EAAT2的mRNA水平變化(n=3)

圖2 各組小鼠紋狀體內EAAT1及EAAT2的蛋白水平變化(n=3)

3 討論

隨著我國老齡化程度的加劇，PD的患病率急劇增長，并維持在較高水平[13]。Glu的過量堆積是PD發病機制中的一個重要環節，與PD發病密切相關。其中，EAATs轉運體系統的功能失調是很多PD患者共同的特征[14]。很多針對Glu轉運體調節的分子都顯示出對于神經退行性病變的治療作用，如頭孢曲松、埃他卡林等[15-16]，更重要的是，上調Glu轉運體也能抑制α-突觸核蛋白、tau蛋白及β-淀粉樣蛋白的非正常堆積[17-18]。利魯唑屬于苯噻唑類化合物，有明確的神經保護及抗驚厥等藥理作用，然而，應用其干預興奮性Glu轉運體進而調節PD病理進程的研究很少。Glu轉運體是Na+/K+依賴的，而利魯唑可穩定Na+通道，抑制Glu的釋放，增強Glu轉運體和Glu的結合力，能有效減少Glu在細胞外的濃度[8-9]。因此，推測利魯唑可能會對MPTP導致的PD模型鼠的Glu代謝轉運障礙起到一定的保護作用。

EAAT1、EAAT2是主要表達在星形膠質細胞膜上的Glu轉運體，主要任務是清除細胞外的Glu。本實驗通過連續給予昆明小鼠注射25 mg/kg 的MPTP，共7 d，建立PD模型鼠，并給予0.7 mg/kg利魯唑，以建立利魯唑干預模型。通過轉棒實驗及疲勞儀實驗檢測小鼠的行為學變化，發現MPTP處理組的小鼠的耐力時間與奔跑距離均較對照組縮短，說明造模成功，經過MPTP處理過的小鼠均達到PD患病程度。而經過利魯唑干預后的小鼠以上運動行為學指標都有不同程度的提升，說明利魯唑對于PD患病小鼠確實具有顯著的改善作用。MPTP組小鼠Glu水平顯著高于對照組，說明PD小鼠的紋狀體區發生了Glu的過量堆積或者代謝異常。而利魯唑可能會對Glu重攝取有促進作用。為分析其原因，本研究進一步檢測了紋狀體EAAT1、EAAT2蛋白及mRNA 表達，結果顯示，MPTP組小鼠黑質紋狀體區的EAAT1、EAAT2的蛋白及mRNA水平均下降，而利魯唑治療后，這兩種轉運體的蛋白及mRNA水平較MPTP組相比顯著回升，說明利魯唑對于PD模型鼠的Glu代謝轉運障礙具有保護作用。

1996年即有研究者報道，利魯唑在帕金森疾病模型鼠中具有保護性作用，利魯唑降低了阿撲嗎啡誘導的對側旋轉和苯丙胺誘導的同側旋轉，也可以減輕6-羥基多巴胺引起的黑質-紋狀體多巴胺能神經元病變[19]。在2000年，Boireau等[20]檢測了給予小鼠注射MPTP后，利魯唑對小鼠紋狀體內MPP(+)形成和積累的影響，發現利魯唑并沒有影響MPP(+)的積累，說明利魯唑對MPTP毒性的保護作用并不是因為影響了MPTP在體內的代謝。Obinu等[21]通過給予帕金森病絨猴利魯唑治療后，發現利魯唑治療的絨猴保持了更好的運動功能和神經功能。利魯唑可以保護多巴胺能神經元，并減少帕金森病模型中的行為缺陷。但是，目前關于利魯唑對帕金森模型保護的具體機制的研究甚少，本研究著眼于機制學，證實了利魯唑的神經保護功能，也發現了利魯唑可通過EAAT1、EAAT2促進Glu的重新攝取，從而發揮PD保護作用。

綜上所述，本研究重新探索了利魯唑的其他治療應用，從帕金森病的發病機制-紋狀體區的Glu代謝轉運異常出發，發現利魯唑對PD小鼠紋狀體區Glu過量堆積以及轉運異常具有抑制作用，并認為通過保護EAAT1、EAAT2的數量及功能可以產生神經保護作用，在一定程度上為臨床應用利魯唑治療帕金森病提供實驗理論依據。