黃精多糖通過調節JAK2/STAT3通路改善異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥厚

方歡樂，李瑤瑤，陳晶晶，安 昌，陳渝婷，楊永華

0 引言

心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVD)如高血壓、冠心病是危害人類健康的首要疾病[1-2]。心肌肥厚導致心臟重塑是引發多種CVD發生率升高的重要因素。因此，臨床治療心血管疾病的重點是減緩甚至逆轉心臟重塑，這對于改善患者的長期生存至關重要[3-4]。酪氨酸蛋白激酶/信號轉導子和轉錄激活子(Janus activated kinase signal transducer and activator of transcription，JAK2/STAT3)信號通路是心肌細胞增殖、分化的重要通路，其活性的改變與心肌肥大有著密切關聯[5-6]。黃精為百合科植物滇黃精或多花黃精的干燥根莖，其主要活性成分為黃精多糖(Polygonatumsibiricum polysaccharides，PSP)。研究表明，黃精多糖藥用價值非常高，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、抑菌、抗炎等活性[5]。近年研究表明，黃精多糖干預可抑制炎癥因子的釋放，減輕心肌損傷程度，改善心肌梗死[7]。黃精多糖可清除心肌組織中過量的氧自由基，提高抗氧化酶的活性[8]。本課題前期實驗研究表明，黃精多糖可通過抗炎調節細胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1蛋白表達，改善小鼠心室重塑[9]。但異丙腎上腺素(Isoproterenol,ISO)誘導心肌肥厚過程中活化JAK2/STAT3通路，黃精多糖是否通過阻斷JAK2/STAT3通路保護心肌組織，目前尚未見報道。本研究通過給大鼠皮下注射異丙腎上腺素制作心肌肥厚模型，觀察黃精多糖抑制JAK2/STAT3通路改善心肌肥厚的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只SPF級SD雄性大鼠，體重(180±20)g，購買于中國人民解放軍第四軍醫大學實驗動物中心，許可證編號：SCXK(軍)2017-0007。

1.1.2 藥物與試劑 黃精多糖(多糖含量≥90.0%)，南京景竹生物科技公司。普萘洛爾片，天津力生制藥股份有限公司，批號：20141015；ISO，美國Sigma公司，批號：150513；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化脂質(LPO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，生產批號：1710150、1710181、1710151；抗體JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 由Abcam公司提供。

1.1.3 儀器 MK3全自動酶標儀(賽默飛世爾公司)；XSP-2C數碼生物顯微鏡(深圳市西尼科光學儀器有限公司)；垂直電泳槽、濕電轉膜儀(Bio-Rad伯樂，USA)；Tanon-5200全自動熒光/化學發光成像系統，上海天能科技有限公司。

1.2 動物模型及分組給藥 異丙腎上腺素背部皮下注射5 mg/(kg · d)，1次/d，連續給藥14 d，建立大鼠的心肌肥厚模型[10]。取SD雄性大鼠60只，隨機分為6組，即對照組，模型組(ISO組)，黃精多糖低、中、高劑量組，普萘洛爾組，每組10只。對照組每日1次皮下注射0.9% NaCl，模型組及其他組溶解ISO(5 mg/kg)在生理鹽水中，皮下注射連續給藥14 d造心肌肥厚模型；造模后第2天開始，黃精多糖低、中、高劑量組分別按照200、400、800 mg/kg每天灌胃給藥，普萘洛爾組150 mg/kg灌胃給藥。給藥0.5 h后皮下注射ISO，連續給藥治療1個月。大鼠的體重每4天記錄1次。在實驗結束前1 d禁食，自由飲水。

1.3 大鼠心臟重量參數測定 稱量大鼠體重(BW)，麻醉，腹主動脈取血后，取出心臟，PBS清洗殘血，濾紙吸干后稱量全心重(HM)，計算心重指數(Heart mass index，HMI=HW/BW)。分離左心室，稱取重量，計算左室重量指數(Left ventricular mass index，LVMI)，即左心室重量(LVW)與體重(BW)的比值(LVW/BW)。

1.4 大鼠心臟標本形態學檢測 取大鼠心臟標本，切取左心室約50 mg，放置在10%甲醛溶液中固定，24 h后取出心臟用蒸餾水反復沖洗，梯度乙醇溶液脫水后過夜，用石蠟包埋、切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色。數碼生物顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學改變、照相分析。

1.5 大鼠血清生化指標檢測 大鼠用20%烏拉坦溶液麻醉，腹主動脈取血，EP管收集血液5 ml左右。使用離心機3 600 r/min離心20 min，取上清液，按照試劑盒說明檢測氧化應激指標SOD、MDA、GSH-Px、LPO的含量。

1.6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定炎性指標TNF-α、IL-6濃度 取血，離心方法參照“1.5”項。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定TNF-α、IL-6濃度，檢測450 nm處OD值，實驗操作步驟按試劑盒說明書方法進行。

1.7 Western blot法測定心臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表達情況 取各組部分心臟組織加入裂解液，于冰浴上進行勻漿裂解，12 000 r/min低溫離心15 min。取上清液BCA法測定蛋白濃度。應用8%PAGE上膠分離上樣蛋白，濕法轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶37 ℃封閉膜45 min。取出分別加入特異性抗體JAK2、STAT3(1∶200)、p-JAK2、p-STAT3(1∶500)、GAPDH(1∶5 000)，孵育1 h后4 ℃過夜。次日TBST洗膜，加入二抗，孵育45 min后洗膜。加化學發光試劑孵育，暗室發光。照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 software分析。

2 結果

2.1 黃精多糖對心肌肥厚大鼠心臟質量指數和左心室指數的影響 ISO皮下注射致大鼠心肌肥厚，結果顯示，模型組大鼠HMI、LVMI較對照組顯著增加(P<0.01)，表明模型建立成功。用藥物治療1個月后，與模型組比較，高劑量黃精多糖和普萘洛爾可顯著抑制大鼠心臟指數及左心室指數的增加(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 黃精多糖對心肌肥厚大鼠心臟質量指數和左心室指數的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，* *P<0.01

2.2 黃精多糖對心肌肥厚大鼠心肌組織形態學的影響 大鼠心肌組織HE染色結果顯示，對照組大鼠心肌細胞形態正常、排列緊密。與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞增大、間隙增寬。藥物治療后，黃精多糖中、高劑量組及普萘洛爾組心肌細胞形態相對正常，細胞排列緊密(與對照組比較)，表明藥物具有保護受損的心肌細胞的作用。見圖1。

2.3 黃精多糖對心肌肥厚大鼠血液中SOD、GSH-PX、MDA、LPO 活性的影響 由表2可知，與對照組比較，模型組大鼠血液中脂質氧化產物MDA、LPO含量明顯增加，抗氧化產物SOD、GSH-PX含量顯著下降(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，黃精多糖中劑量組MDA、LPO含量降低(P<0.05)，中劑量組GSH-PX含量升高(P<0.05)，高劑量組及普萘洛爾組SOD、GSH-PX含量升高(P<0.05，P<0.01)，中、高劑量組及普萘洛爾組MDA、LPO含量降低(P<0.05，P<0.01)。

圖1 各組大鼠心肌組織光鏡下病理形態學改變(HE，400×)

表2 黃精多糖對心肌肥厚大鼠血液中SOD、GSH-PX、MDA、LPO 活性影響

注：與模型組比較，*P<0.05，* *P<0.01

2.4 黃精多糖對心肌肥厚大鼠血TNF-α、IL-6含量的影響 模型組大鼠血TNF-α、IL-6含量高于對照組(P<0.01)。與模型組比較，黃精多糖中、高劑量組及普萘洛爾組大鼠血TNF-α、IL-6含量降低(P<0.01，P<0.05)。見表3。

表3 黃精多糖對心肌肥厚大鼠血液中TNF-α、IL-6含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，* *P<0.01

2.5 黃精多糖對心肌肥厚大鼠心臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響 白細胞介素(IL)-6可使得JAK2磷酸化而激活，磷酸化的JAK2催化其下游STAT3發生磷酸化后，引發心肌肥厚[11]。本研究進一步檢測了心肌肥厚大鼠心臟組織中JAK2、p-JAK2 和STAT3、p-STAT3 蛋白表達。結果顯示，與對照組比較，模型組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達提高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，黃精多糖中、高劑量組及普萘洛爾組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達下調(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

3 討論

臨床研究表明，心肌肥厚是引起心血管疾病發生率顯著升高的重要危險因素，早期的心肌肥大具有一定的代償意義，但持續加重的心肌肥大終將導致心力衰竭的發生[11-12]。異丙腎上腺素通過激活動物腎上腺素受體促進多種信號轉導通路，刺激心肌細胞內相關蛋白的合成及表達，引起膠原沉積出現心肌肥厚。模擬這一失代償過程，可觀察到心臟體積增大、心肌細胞肥大、氧化代謝異常，心肌中促炎因子表達增加[13-14]。促炎因子如TNF-α、IL-6等參與心肌肥厚的發生[15]，調控細胞增殖、分化、生長及代謝等。

圖2 各組大鼠心臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達

炎癥可進一步引起內皮細胞損傷、活性氧產生，導致機體氧化平衡系統失衡，活性氧清除功能降低，使氧自由基大量堆積[16]。近年研究表明，黃精多糖可減輕炎癥反應、提高氧自由基清除能力，對急性心肌梗死模型大鼠心肌損傷有保護作用[17]。本研究顯示，與對照組比較，異丙腎上腺素引發的心臟肥厚過程中心臟體積增大、心體重比增高，HE染色的心肌細胞肥大，抗氧化指標SOD、GSH-PX減少、脂質氧化產物MDA、LPO增多，炎癥標志物IL-6、TNF-α含量明顯升高。治療1個月后，與模型組比較，黃精多糖中、高劑量組各項指標均得到改善，表明黃精多糖具有一定的抗氧化抗炎、改善心肌肥大作用。

心肌肥厚是慢性心力衰竭主要的病理改變之一，其中 JAK/STAT信號通路是引起心力衰竭心肌重塑改變的重要發病機制，血清 JAK水平是反映心肌肥厚、心肌重塑程度的指標[18]。JAK/STAT途徑主要在心肌細胞中發現，是連接細胞表面受體到細胞核轉錄的一種直接信號傳導途徑。在導致心肌細胞肥大的各種病理情況下，該途徑可被一些細胞分裂素和生長因子激活，在心肌肥厚形成過程中具有重要意義[19-20]。Western blot檢測結果顯示，模型組心肌細胞中p-JAK2、p-STAT3表達上調；黃精多糖中、高劑量組可以抑制異丙腎上腺素引起的p-JAK2、p-STAT3表達增加，提示黃精多糖可能通過抑制JAK2/STAT3信號傳導通路的激活來減輕心肌肥厚程度和炎癥反應，產生保護心臟作用。

綜上所述，黃精多糖對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥厚有一定保護作用。