納米粒介導的曲安奈德遞送對治療糖尿病大鼠視網膜病變的影響

胡 浩，蔡江雄，林 然，江靈莉

0 引言

糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者晚期的并發癥之一，是導致患者視力下降的重要原因[1-2]。糖尿病患者的高血糖導致氧化應激、炎癥、血管通透性和視網膜神經變性，最終出現DR[3-5]。DR演變一般經歷兩個階段：早期非增殖階段(NPDR)和晚期增殖階段(PDR)[2]。NPDR階段特點是各炎癥介質如腫瘤壞死因子α(TNF-α)，核因子κB(NF-κB)和細胞間粘黏附分子-1(ICAM-1)在視網膜上的產生增加[6]，持續的缺氧和產生這些炎癥介質使其發展到PDR階段。PDR的特點是分泌血管生成介質增強，包括低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內皮生長因子(VEGF)的增加，血視網膜屏障的破壞和微血管叢在視網膜毛細血管的形成[7-8]。炎癥和血管生成介質的產生導致視網膜膠質細胞的應激反應，其特征是增強膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的產生，光感受器細胞功能損傷或光感受器細胞凋亡，最終導致失明[8-9]。因此，DR引起視網膜組織的結構和功能異常，需要治療干預控制疾病進展。

有研究表明，聚合物納米粒(NPs)由于其緩釋作用，能夠提供持續幾天甚至幾個月的藥物分子供給[10]。由于高表面積與體積比，這些傳遞系統通過細胞內吞機制很容易被細胞內吞，同時也促進藥物通過緊密的細胞連接運輸[11]。此外，聚合物NPs的組成控制著粒子-組織的相互作用，而粒子組織的相互作用又控制著藥物在眼睛局部的時空分布[12]，眼組織層對親水性和疏水性分子具有不同的滲透性[13]。我們假設通過設計納米輸送系統，由于其表面親水性/疏水性可優先與眼層組織相互作用和發生滲透，從而提高視網膜的藥物生物利用度[12]。此外，通過生理屏障的抵抗清除，NPs的大小也決定了局部給藥藥物的視網膜生物利用度[14]。因此，本研究制備一種基于PCL和PF68形成核殼結構的納米粒輸送系統，包括一個疏水聚已酸內酯核和親水普朗尼克?F68殼來裝載用于包載曲安奈德(TA)，評價其在糖尿病(DR)大鼠模型中的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料 聚己內酯(PCL)、聚乙丙交酯(PLGA)、聚乳酸(PLA)、pluronic?F-68(PF68)、殼聚糖(CHI)、明膠(GEL)、聚乙烯醇(PVA)、多聚賴氨酸(poly-L-lysine)、鏈脲佐菌素(STZ)購自阿拉丁；曲安奈德(TA)藥購自天津市金匯藥業有限公司；胎牛血清購自Thermo scientific。

1.2 NPBs、NPDs的制備 將0.25%(w/w)的PF68 作為水相、0.5%(w/w)的PCL和0.05%(w/w)TA丙酮溶液作為有機相，水相與有機相以2∶1(v/v)比例混合并充分攪拌。制備NPBs時，不加TA，用旋轉蒸發儀(上海申順生物科技有限公司)在低壓下蒸發有機溶劑。所形成的膠體懸浮液經過夜攪拌去除殘留有機溶劑。然后用去離子水重懸，離心分離NPs，最后用凍干法制得NPBs或NPDs。

1.3 PCL-PF68 NPs的形態學特征、尺寸和Zeta電位 利用掃描電子顯微鏡(EVO 18)對其表面形貌進行表征(SEM)，放大60 000倍和100 000倍觀察。采用馬爾文激光粒度儀(Zetasizer，Nano ZS90)確定NPBs和NPDs的粒徑大小。用于NPs分散的介質是DI水。采用激光多普勒測速與相位分析光散射相結合的方法確定NPs的ζ電位。

1.4 NPs的包載效率和藥物負載 為了評估載藥NPs的包封效率，將其分別溶于氯仿，在238 nm處用紫外-可見分光光度計記錄各自溶液的吸光度。將TA在氯仿中溶解(10～80 μg/ml)繪制的標準曲線來確定。藥物負載和包封率的計算公式如下：

1.5 TA裝載PCL-PF68 NPs的藥物釋放動力學 評估在PBS(pH=7.4)中 PCL-PF68 NPs中TA的體外釋放動力學。NPDs懸浮于PBS(0.05%，w/v)并放入透析袋(10 kDa)，置于15 ml的PBS透析介質中，溫度37 ℃。在指定時間點從PBS中取1 ml樣品，用紫外分光光度法測定TA濃度。取樣后，等量的PBS緩沖液添加以補充介質。用NPs釋放的TA濃度表示累積釋放，繪制出時間函數。

1.6 PCL-PF68 NPs體外細胞相容性研究 采用角膜上皮細胞系(SIRC)進行NPBs和NPDs的細胞相容性研究。檢測不同濃度的NPs(0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml)確認急性和慢性毒性。將細胞(含有10%FBS的DMEM中培養)以3.5×105個細胞/孔的密度接種在96孔板中，于37 ℃下、5%CO2的培養箱中孵育24 h，加入NPs，再孵育24 h以獲得急性毒性，并在進行MTT測定之前將其孵育72 h，以獲得慢性毒性。MTT法測定吸光度為560 nm，背景吸光度為690 nm。未處理的細胞作為有100%存活率的陽性對照，未添加試驗試劑的細胞作為空白對照。相對細胞存活率的計算公式如下(數據取3次測量的平均值)：

1.7 DR大鼠模型的建立及分組 雄性Sprague Dawley大鼠，體重(230±14)g，3個月，獲自溫州醫科大學動物實驗中心，飼養條件為溫度(22±2)℃，相對濕度50%，光照/黑暗周期12 h。對照組大鼠以0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)作為載體，實驗組大鼠單次腹膜內注射35 mg/kg STZ(0.1 mmol/L pH 4.5檸檬酸鈉緩沖液配制成1% STZ溶液)。STZ注射72 h后通過監測空腹血糖水平>120 mg/d為造模成功。對照組和糖尿病動物均正常飲食，每周記錄每只動物的體重和血糖濃度，每周2次向血糖濃度≥350 mg/dl的糖尿病大鼠腹腔注射胰島素。在10周結束時，將動物隨機分成2組(2個時間點：20 d、40 d)。將這些不同時間點的組分成3個亞組：亞組-Ⅰ[糖尿病大鼠對照組-左眼提供PBS(PBS)，右眼在PBS(D)基礎上提供TA]，亞組-Ⅱ糖尿病大鼠實驗組-左眼提供安慰劑NPs(NPB)，右眼提供TA負載的NPs(NPD)]，亞組-Ⅲ[非糖尿病大鼠對照組-左眼和右眼均提供PBS作為滴眼液(對照)]。每天2次應用大約25 μl的滴眼劑(早6∶00和晚17∶00)。治療持續20、40 d，在兩個不同時間點(第21天和第41天)處死大鼠，并將眼球用于組織病理學分析。

1.8 組織病理學分析 在大鼠安樂死之后，將眼球摘出并用于組織病理學分析。將眼球摘出并切成兩個半球以除去晶狀體和玻璃體液，并置于4%多聚甲醛(PFA)中，固定48 h，包埋在石蠟塊中并切片。將切片脫石蠟并在乙醇溶液(100%、95%、70%乙醇)的梯度中水合。視神經頭的矢狀面取向的中央部分用于測量。切片用蘇木精-伊紅進行HE染色，并使用顯微鏡捕獲圖像。此外，通過image J軟件確定所有亞組的視網膜層的厚度之和。

2 結果

2.1 空白PCL-PF68的制備和表征 使用納米沉淀法成功制備了NPBs和NPDs。NPs的SEM成像表明NPs呈球形，具有光滑的形態(圖1A、1B)。納米粒徑測定儀測定結果顯示，NPB和NPD的平均流體動力學直徑分別為(163±4)nm和(184±2)nm(圖1C)，尺寸均勻，多分散性低。NPBs和NPDs的ζ電位分別為(-21±5)mV和(-13±1)mV(圖1D)。

2.2 NPs的載藥量 NPDs的包封率為60%，載藥量為(60±5)μg/mg。

2.3 TA負載的PCL-PF68 NPs藥物釋放動力學 藥物釋放動力學結果顯示，在最初的7 d內，釋放了約60%的藥物，然后在接下來的18 d內持續釋放(圖2A)。初始釋放后持續釋放，在20 d內釋放80%的藥物。

圖1 TA負載(NPD)和空白(NPB)PCL-PF68 NPs的表征

圖2 TA負載(NPD)的藥物釋放及細胞相容性

2.4 PCL-PF68 NPs體外細胞相容性研究 在24 h 暴露的試驗濃度下，NPBs、NPDs的細胞存活率均為100%，表明NPBs和NPDs的細胞相容性(圖2B)。與NPBs孵育72 h后，細胞活力超過100%，而NPDs細胞活力為92%±8%。見圖2C。

2.5 組織病理學分析 不同滴眼液治療后，觀察視網膜組織病理。HE染色的視網膜圖像顯示，滴眼治療20 d后，各治療組的視網膜層厚度比較差異無統計學意義(圖3A、圖3B)。然而，治療40 d后，與糖尿病組(PBS、NPB和游離藥物)相比，非糖尿病對照組和NPD治療的眼睛顯示出更厚的視網膜層(圖3A、圖3C)。此外，NPD處理組和非糖尿病對照組動物眼睛的厚度相當。

3 討論

DR已成為我國4大致盲眼病之一。TA作為一種非水溶性的糖皮質激素，具有強大的抗炎作用，其用于治療DR主要是能夠降低炎癥血管的滲透性，穩定血眼屏障[15]。但是由于眼部特有的解剖結構，常規眼部制劑一般很難達到視網膜發揮作用，用藥受到限制[16]。具有控釋性的納米粒子在眼部視網膜疾病中比常規治療的效果更好，能保持有效的藥物治療濃度，有效抑制新生血管，且對眼組織無毒性作用[17-19]。

為此，我們通過設計納米輸送系統，提高視網膜的藥物生物利用度[12]。本研究使用PCL和PF68形成核殼結構的納米粒輸送系統用于包載TA，成功制備了球形NPBs和光滑形態的NPDs，結果表明，兩親性PF68分子在制備過程中穩定了疏水性PCL NPs。PF68的穩定作用可能是由于PF68中存在PPO和PEO單元。PPO單元與疏水性PCL鏈相互作用并使PEO鏈可與水相互作用，以形成穩定的核-殼NPs[20]。此外，NPDs的Zeta電位略有正向變化，可能是由于NPs表面存在中性TA分子。同樣，PCL核心的疏水性質為疏水性藥物TA提供了最佳包封效率，這可歸因于PCL和TA之間的疏水相互作用。

藥物的初始釋放是由NPDs表面吸附藥物引起的。研究表明，藥物的持續釋放是由于PCL在水介質中的降解速度較慢導致膠囊藥物的緩慢釋放[10]。我們的研究結果與降解動力學數據一致，表明在初始時間點，NPs的降解速度較慢。推測聚合物降解導致水分子滲透到NPs的大部分中，進而導致藥物溶解和擴散。

由于NPDs的最終應用涉及與眼組織接觸，因此，其所需的濃度應顯示治療效果，同時提供最小或無細胞毒性作用。因此，通過將其以遞增濃度暴露于SIRC細胞系的2個持續時間，24 h(急性細胞毒性)和72 h(慢性細胞毒性)來研究NPs的細胞相容性。本研究結果顯示，NPBs暴露72 h后的存活率較高，可能是由于納米粒誘導的氧化應激導致細胞在與NPBs孵育時增殖增強所致[21]。此外，NPDs孵育后細胞活力下降(雖然不明顯)，可以歸因于TA的抗增殖作用[22]。組織病理學結果表明，用NPDs處理改善了視網膜結構的完整性。這可能是由于藥物輸送系統在視網膜上呈現更高濃度的TA，會減少炎癥、VEGF分泌和內皮細胞增殖，從而提高治療效果。

圖3 不同滴眼劑處理20、40 d后大鼠視網膜的組織病理學分析

4 結論

綜上所述，TA負載的PCL-PF68核-殼納米粒在作為滴眼劑施用時將TA遞送至視網膜，這是向眼組織施用藥物的無創且安全的模式，其避免了與玻璃體內注射相關的缺點。這種將TA以治療濃度傳輸到視網膜的能力不僅能減少炎癥，還能改善DR大鼠視網膜的結構和功能活性。因此，TA負載的PCL-PF68核-殼納米粒可用于大鼠DR的無創性治療，并且可以在諸如靈長類動物的高等動物中進一步評估后外推至人類。因此，本研究表明，基于聚合物納米粒的滴眼劑制劑有可能被開發為用于治療多種視網膜疾病的平臺技術。