miR-130b與碘難治性分化型甲狀腺癌的關系研究

李德宇，李 娜，李文亮，李東麗，楊 輝，王麗君

0 引言

甲狀腺癌(Thyroid carcinoma，TC)是臨床上最常見的內分泌系統惡性腫瘤之一，近年來，隨著對甲狀腺良性病變及甲狀腺癌篩查力度的加大，我國甲狀腺癌的確診率逐年上升[1]。90%以上的TC患者都屬于分化型甲狀腺癌(Differentiate thyroid carcinoma，DTC)，雖然DTC患者的預后良好，生存率較高，但是部分腫瘤細胞仍存在浸潤性行為[2]。131I照射是目前臨床上的主要治療手段之一，可用于術后清甲或清除復發和轉移病灶[3]。但是臨床上仍有部分DTC患者治療無效或治療一段時間后逐漸無效[4]，因此，在131I照射前尋找新的特異性指標對于預后評估以及個體化治療具有重要的臨床意義。近年研究發現，越來越多的miRNAs與腫瘤的發生密切相關[5]，研究者開始關注miRNAs作為多種腫瘤診斷和治療標志物的潛力。以往大多數的研究集中在診斷TC與良性結節的差異上，關于miRNAs與131I攝取的關系探討尚少。筆者基于前期調查和研究，篩選了與DIC密切相關的miR-130b作為候選標志物，通過實驗室方法檢測miRNAs在碘難治性DTC(Radioiodian refractory differentiate thyroid carcinoma，RR-DTC)患者腫瘤組織中的表達情況，探討其診斷價值及其與預后的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月至2015年12月在我院就診并行甲狀腺全切除后聯合131I照射治療的遠處轉移DTC患者104例，男65例，女39例，年齡28～76歲，平均年齡為(55.67±10.25)歲。收集患者新鮮組織標本，立即置于液氮中暫時保存，待送到實驗室后保存至-80 ℃，用于提取組織RNA。所有患者均符合2015年由美國甲狀腺學會發表的“The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer”[6]中關于DTC的診斷標準。其中甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)93例，甲狀腺濾泡狀癌(Follicular thyroid carcinoma，FTC)11例。本項研究獲得我院倫理委員會的批準。

1.2 入選和排除標準

1.2.1 入選標準 ①行甲狀腺全切除患者。②至少接受2個療程131I照射治療。③經病理活組織檢查確診為DTC。④所有患者均符合遠處轉移DTC的診斷標準：經骨穿刺或術后病理證實為遠處轉移；131I全身顯像提示發生遠處轉移，甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin，Tg)水平升高，X線、CT或MRI等影像學檢查中至少1種提示陽性；符合上述任意1條，可判斷發生遠處轉移。⑤臨床資料完整。⑥患者簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準 ①不符合上述納入標準的患者；②合并其他腫瘤者；③合并嚴重高血壓、心律失常、冠心病及心功能不全者；④合并肝腎功能嚴重損傷，不能耐受131I照射治療者；⑤合并凝血功能異常或有嚴重出血傾向者；⑥中途自愿退出者。

1.3 研究方法

1.3.1 實驗分組 隨訪36個月，中位隨訪時間為28.5個月。根據影像學檢查結果，原發灶和轉移灶消失或縮小即為治療有效，將患者分為RR-DTC組和碘治療有效組(R-DTC組)。碘治療有效的判斷標準包括治愈和好轉。治愈：131I照射5～7 d，全身顯像及輔助影像學檢查顯示原發灶及轉移灶消失，Tg水平維持在2 ng/ml以下；好轉：原發灶縮小，轉移灶大小和數量也減少，Tg水平下降。RR-DTC診斷標準：根據2015年ATA指南，出現以下任何一項則可判斷為RR-DTC：①腫瘤組織或轉移灶不攝碘；②曾經攝碘的病灶在碘治療后喪失攝碘能力；③碘治療后僅部分病灶攝碘；④雖然病灶可攝碘，但是碘治療后仍然出現疾病進展。

1.3.2 熒光定量實時PCR(Quantitative real-time-PCR，qRT-PCR) 提取總RNA：①取腫瘤組織樣本約100 mg，置于EP管中；②加入1 ml預冷的Trizol，充分混合均勻，靜置5～10 min；③加入200 μl 氯仿，震蕩30 s，靜置5～10 min；④12 000 r/min離心，取上清；⑤加入500 μl異丙醇，震蕩30 s，靜置5～10 min；⑥12 000 r/min離心，棄上清；⑦加入1 ml 75%乙醇，震蕩30 s，12 000 r/min離心，棄上清；⑧將EP管倒置于濾紙上，將RNA充分干燥；⑨加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分裝，置于-80 ℃ 保存備用。采用miRNA isolation kit試劑盒提取miRNA。采用凝膠電泳檢測RNA分子量；采用分光光度計檢測RNA濃度。

RNA反轉錄：根據試劑盒說明書操作進行。將cDNA置于-20 ℃保存備用。

實時定量PCR：將20 μl反應體系置于37 ℃恒溫水浴60 min，85 ℃ 5 s，加入去離子水至100 μl，各反應孔取2 μl進行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反應體系，95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環45次。根據NCBI數據庫獲得的資料設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。采用mirVanaTM qRT-PCR miRNA detection kit試劑盒進行定量測定。引物序列如下：miR-130b F：5′-TACCACGATAAGCAGGAAGTGA-3′，R：5′-CTCCTCTCCTGGCTTTTCTACC-3′。

結果判定：根據使用說明調整基線，將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(隨機陰性對照樣品Ct均值-內參Ct均值)，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。小干擾RNA引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；DNeasy組織試劑盒、cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、miRNA isolation kit試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.3.3 血清學檢測 所有患者131I照射治療前后分別采集血液樣本，采用化學發光免疫分析法檢測Tg水平，計算Tg同比下降率。Tg同比下降率=(Tgbaseline-Tg)/ Tgbaseline。

1.3.4131I全身顯像半定量分析 利用SPECT Region-of-interest軟件對所有患者131I照射治療后進行131I攝取半定量分析。轉移灶131I攝取(Tumor/Backgroud，T/B)=腫瘤病灶攝取量/本底攝取量(以正面額骨的攝取量為準)，比值越大，說明131I攝取越好。

2 結果

2.1 兩組患者基線資料分析 影像學檢查結果顯示，接受131I照射治療后，41例患者為RR-DTC，63例患者為R-DTC。兩組患者年齡、性別、病理類型、累積I放射量等一般臨床資料基本一致，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。但是RR-DTC組患者發生遠處多發轉移的比例高于R-DTC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 兩組患者組織miR-130b、血清學指標、影像學指標比較 見表2、圖1。131I照射治療前，R-DTC組和RR-DTC 組患者腫瘤組織miR-130b水平分別為0.79±0.10和0.43±0.07，RR-DTC組患者miR-130b水平明顯低于R-DTC組患者，而血清Tg水平高于R-DTC組患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。治療后，R-DTC組患者血清Tg水平為(25.94±17.48)μg/L，較治療前明顯降低，同時也低于RR-DTC組患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。RR-DTC組患者Tg同比下降率和T/B分別為10.13%±9.87%和4.29%±1.64%，明顯低于R-DTC組患者，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組患者基本資料比較(例)

表2 兩組患者組織miR-130b表達、Tg及T/B水平比較

2.3 miR-130b與Tg同比下降率、T/B的相關性 經Spearman相關性分析結果顯示，組織miR-130b與血清Tg同比下降率和T/B呈正相關性(rs=0.928、0.896，P<0.05)。見圖2。

圖1 qRT-PCR法檢測miR-130b在R-DTC、RR-DTC患者腫瘤組織中的表達水平

2.4 miR-130b診斷ROC曲線分析 ROC曲線分析結果顯示，miR-130b診斷RR-DTC的截斷值為0.485，曲線下面積(Area under curve，AUC)為0.662。根據miR-130b的截斷值，將41例RR-DTC患者分為<0.485亞組(23例)和≥0.485亞組(18例)。見圖3。

圖2 miR-130b與Tg同比下降率、T/B的相關性分析

2.5 RR-DTC生存曲線分析 隨訪截至2018年6月，中位隨訪時間為28.5個月。RR-DTC組有24例患者死亡，其中<0.485亞組有15例患者死亡，3年生存率為34.78%；≥0.485亞組有9例患者死亡，3年生存率為50.0%。采用Kanlan-Meier法對RR-DTC亞組患者進行生存分析，經Log-rank檢驗，<0.485亞組和≥0.485亞組患者3年生存率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖3 miR-130b診斷RR-DTC的ROC曲線分析

圖4 Kanlan-Meier生存曲線分析

3 討論

甲狀腺癌是常見的內分泌系統惡性腫瘤之一，多為分化型甲狀腺癌，包括PTC和FTC兩種病理類型[7]。相對于未分化性甲狀腺癌或甲狀腺髓樣癌，DTC的總體預后良好，10年生存率可達85%以上[8-9]。目前，臨床上關于DTC治療的標準方案為甲狀腺切除術+131I內照射+激素替代治療[10]。但是有部分患者對131I內照射無效，或者初始治療有效，經治療一段時間后無效，對于這部分患者治療方法的研究一直是內分泌腫瘤領域亟待攻克的難點。由于RR-DTC患者多伴有多發性轉移灶，不宜采取手術治療，且攝碘能力較弱或完全喪失，同時這類腫瘤細胞的侵襲性明顯升高，給治療和預后帶來了極大挑戰[11]。推測其可能的原因包括：①部分腫瘤細胞本身缺乏攝碘能力或者攝碘能力較弱；②在進行131I內照射前，腫瘤細胞攝碘能力存在較大的差異性，經內照射后，攝碘能力強的細胞被殺死，而剩余攝碘能力較弱的腫瘤細胞繼續增殖、侵襲等；③經內照射后，部分腫瘤細胞代謝活性可能發生變化，從而失去碘攝取能力[12]。一旦患者被確診為DTC，則無法繼續接受131I內照射靶向治療，需考慮其他治療方案，包括放療、射頻消融、動脈栓塞和靶向治療等[13]。近年來，隨著對甲狀腺癌發病機制研究的深入，越來越多的分子靶向藥物用于臨床，為RR-DTC患者帶來了希望。

Tg是甲狀腺癌復發和轉移的特異性標志物，主要由甲狀腺濾泡上皮細胞合成并分泌，在正常生理情況下，或者經甲狀腺手術全切除和“清甲”治療后，血液中Tg的含量極微；若出現腫瘤復發，則血清中Tg含量明顯升高[14-15]。因此，臨床上一般通過檢測Tg水平預測手術后或“清甲”術后患者疾病進展。但是對于RR-DTC患者，由于“清甲”治療無效，甲狀腺病灶組織一直存在，因此，很多研究認為，血清Tg水平可作為131I治療成功的預測指標。但是，由于血清Tg受外界因素和內在因素的影響，尤其是受甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody，TgAb)的影響較大，且評估作用尚不明確，在2015年更新的ATA指南中，并沒有明確推薦血清Tg用于指導臨床治療[6]。131I全身顯像一直是臨床上用于探查不攝碘病灶最有效的手段，但是131I全身顯像也會出現假陰性結果，這可能由于部分腫瘤細胞去分化，Na/I轉運能力失衡，從而影響131I的攝取[16]。因此，尋找RR-DTC更為敏感的分子標志物，對于個體化治療具有重要的臨床價值。

miRNA屬于非編碼基因序列，與真核生物體多數基因的表達調控均密切相關，包括癌基因和抑癌基因等。近年來，多項研究結果顯示，miRNA與分化型甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲、轉移、凋亡等惡性生物學行為密切相關，并可作為潛在的分子診斷工具及預后評估指標[17]。目前，國內外臨床研究基本都是將miRNAs作為良、惡性甲狀腺病變的診斷指標，包括miR-146b、miR-222等[18]，但是關于miRNAs與碘攝取相關性的研究尚少。最近有研究顯示，一些miRNAs可能與131I攝取率有關，例如，Lakshmanan等[19]認為，miR-339-5p過表達可以抑制HEK293細胞131I攝取量，從而抑制NIS的表達。筆者在前期研究中，通過基因芯片技術篩選了碘難治性分化型甲狀腺癌與碘治療有效的DTC患者miRNAs表達的差異性，其中miR-130b、miR-486-5p、miR-7表達均明顯下調，尤其是miR-130b下調最為明顯，兩組DTC患者比較，差異有統計學意義[P<0.05，log2(fold-change)=-1.253]。因此，筆者基于前期研究結果，通過qRT-PCRT技術分析腫瘤組織中miR-130b表達水平與RR-DTC發生的相關性。結果顯示，RR-DTC患者miR-130b水平明顯低于碘治療有效組患者，但Kanlan-Meier生存曲線分析顯示，miR-130b表達水平與RR-DTC患者3年生存期之間未見明顯相關性，可能與本身DTC在我國的發病率較低，從而影響研究納入的患者樣本量有關。

綜上所述，碘難治性分化型甲狀腺癌患者腫瘤組織中miR-130b表達水平明顯低于碘治療有效的分化型甲狀腺癌患者，雖然本項研究未得出關于miR-130b與碘難治性分化型甲狀腺癌患者預后的相關性，但是miR-130b仍然有望成為診斷分化型甲狀腺癌攝碘能力的輔助指標之一，從而為探索碘難治性分化型甲狀腺癌的篩查和診斷提供了新的思路。