枸骨莖葉甲醇粗提物及其抑菌活性初步研究

張金蒙，許秋澗，陳洋，蔡敏，文念念，張少虎，曾志剛

(湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北 咸寧 437100)(湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北 咸寧 437100 湖北省香花植物工程技術(shù)研究中心，湖北 咸寧 437100)

天然產(chǎn)物是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要資源，從天然產(chǎn)物中篩選先導(dǎo)化合物及以天然產(chǎn)物為探針發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)是天然產(chǎn)物研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，是利用天然產(chǎn)物創(chuàng)制新農(nóng)藥的主要途徑[1]。枸骨(Ilexcornuta)為冬青科冬青屬藥用植物，資源豐富，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)。枸骨提取物化學(xué)成分豐富，藥理活性多樣，具有較高的研究?jī)r(jià)值。

枸骨的根、枝、葉和果都可用于制藥[2,3]。枸骨葉具有多種藥理活性，如清熱養(yǎng)陰、平肝益腎等[3]，亦可作為避孕和心血管疾病藥物以及抗菌劑[4]。枸骨根有祛風(fēng)止痛的功效，用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、腰肌勞損、頭痛、牙痛以及黃疸型肝炎等病癥，是一種具有重要藥用價(jià)值的中藥材[5]。近年來研究表明，枸骨莖葉主要成分為三萜及三萜皂苷、黃酮及其苷類、木質(zhì)素類及脂肪酸類化合物[3～7]。這些化合物具有治療喉嚨痛、減肥、緩解高血壓、抗氧化、抗糖尿病及抑制細(xì)菌等作用[4,8～12]。

枸骨提取物的農(nóng)藥活性研究相對(duì)較少且主要集中在其內(nèi)生菌方面。陳列忠等[13]、石一珺等[14]和申屠旭萍等[15]報(bào)道了枸骨內(nèi)生真菌哈茨木霉(Trichodermaharzianum)及其產(chǎn)生的抗真菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物Trichodermin。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，哈茨木霉菌對(duì)黃瓜立枯病菌存在競(jìng)爭(zhēng)和寄生作用，Trichodermin對(duì)蕃茄早疫病、黃瓜立枯病以及番茄灰霉病有較好的預(yù)防作用和治療作用。劉敏[16]、郭也等[17]報(bào)道了從枸骨葉中分離的內(nèi)生真菌IFB-GLP-4，該真菌具有抗芽孢桿菌活性且能產(chǎn)生新骨架化合物。趙龍飛等[18]研究了從枸骨健康植株的根、莖、葉及果實(shí)中分離得到的85種內(nèi)生細(xì)菌的活性，結(jié)果表明部分菌株對(duì)煙草赤星病菌、稻瘟病菌、棉花枯萎病菌等植物病害具有較好的抑制作用。目前關(guān)于枸骨提取物醫(yī)藥活性的研究比較突出，而農(nóng)藥活性方面的報(bào)道則較為少見。為初步明確枸骨的農(nóng)藥活性，本研究探討了枸骨莖葉甲醇粗提物對(duì)部分植物真菌病害的抑制作用，以期為枸骨的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

枸骨莖葉采摘于湖北科技學(xué)院溫泉校區(qū)附近，置于鼓風(fēng)干燥箱在40℃下烘干，微型粉碎機(jī)粉碎過60目篩，得枸骨莖葉粉末。

供試菌種有水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，均來源于湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，無(wú)菌水1000mL。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備有MP2002電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)、SPX-280生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)、WD900G微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司)、DHG90A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海索普儀器有限公司)、SW-CJ-2FD雙人超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)等。

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 粗提物的制備

首先，將粉碎后的約1.5kg枸骨莖葉粉末倒入2.5L棕色試劑瓶中，用甲醇浸泡7d，期間每隔1～2d進(jìn)行振蕩搖勻。然后，將該甲醇浸提液過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、真空干燥后，得到約30g黑色膏狀物。所得膏狀物密封后置于冰箱保鮮層(4℃)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 粗提物抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[19]測(cè)定粗提物對(duì)供試菌種的抑制作用。首先，將粗提物用70%乙醇溶解，無(wú)菌水溶液稀釋至100mg/mL。然后，吸取2mL上述藥液，與18mL冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基充分混勻，倒入平板，即得含10mg/mL粗提物的培養(yǎng)基。空白對(duì)照為添加相同量的無(wú)菌水。

用打孔器(d=0.5cm)取靶標(biāo)病菌，將所得菌餅移至前述含藥平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)，同一處理重復(fù)3次。當(dāng)對(duì)照平板上菌落布滿至培養(yǎng)皿2/3左右時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。菌絲生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式如下：

式中：DCK為空白對(duì)照菌落直徑;Dt為處理組菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸骨莖葉粗提物的抑菌活性

生物活性測(cè)試結(jié)果表明，10mg/mL的枸骨莖葉粗提物對(duì)水稻稻瘟病、小麥赤霉病、蘋果輪紋病、芒果炭疽病以及香蕉枯萎病等植物真菌病害表現(xiàn)出一定的抑制作用(見表1和圖1)。其中，粗提物在該濃度下對(duì)水稻稻瘟病和小麥赤霉病的抑制活性較好，抑制率分別為100.00%，89.86%。這說明粗提物在防治相關(guān)植物真菌病害方面具有潛在的利用價(jià)值。

表1 10mg/mL的枸骨莖葉粗提物對(duì)供試菌種的抑制作用

注：a1～a5分別為菌株A～E處理菌落；b1～b5分別為相應(yīng)對(duì)照。圖1 粗提物對(duì)5種病原真菌的抑制效果

2.2 枸骨莖葉粗提物對(duì)病菌的毒力效果

鑒于粗提物對(duì)水稻稻瘟病和小麥赤霉病表現(xiàn)出良好的抑制作用，進(jìn)一步研究了粗提物在濃度分別為2、4、6、8mg/mL下對(duì)上述2種病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響(表2、圖2及圖3)，以明確其毒力效果。從表2可以看出，枸骨莖葉甲醇提取物在測(cè)試濃度下對(duì)水稻稻瘟病菌和小麥赤霉病菌均具有一定的抑制活性，不同濃度之間抑制活性差異較為顯著且隨提取物濃度的增大而增強(qiáng)。

粗提物對(duì)靶標(biāo)菌的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)及其毒力回歸方程通過SPSS 22.0軟件計(jì)算求得。其中，粗提物對(duì)水稻稻瘟病菌的毒力回歸方程為y=0.1058x-0.0615，相關(guān)系數(shù)R2為0.9842，EC50為4.616mg/mL。對(duì)小麥赤霉病菌的毒力回歸方程為y=0.063x+0.2507，相關(guān)系數(shù)R2為0.9664，EC50為3.425mg/mL。毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，表明粗提物的濃度和抑菌效果呈正相關(guān)，即粗提物的濃度越高，抑菌效果越好。由此可以看出，枸骨莖葉甲醇提取物對(duì)小麥赤霉病菌和水稻稻瘟病菌防效較好，對(duì)挖掘天然源綠色殺菌分子具有一定的參考意義。

表2 不同濃度枸骨莖葉粗提物對(duì)水稻稻瘟病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用

注：a、b、c、d、e、f分別代表0、2、4、6、8、10mg/mL粗提物圖2 不同濃度粗提物對(duì)水稻稻瘟病菌的活性

注：a、b、c、d、e、f分別代表0、2、4、6、8、10mg/mL粗提物圖3 不同濃度下粗提物對(duì)小麥赤霉病菌的活性

3 結(jié)語(yǔ)

植物性農(nóng)藥生物活性多樣，作用方式復(fù)雜，具高效、低毒、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[20]。從植物中尋找具有農(nóng)藥活性的物質(zhì)，發(fā)掘先導(dǎo)化合物，開發(fā)綠色農(nóng)藥，是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑。枸骨是一種具有較高藥用價(jià)值的植物，是天然產(chǎn)物研究中的熱點(diǎn)。目前關(guān)于枸骨化學(xué)成分及其醫(yī)藥用途的研究較多，而鮮見有關(guān)于其農(nóng)藥活性方面的報(bào)道。本研究結(jié)果表明，枸骨莖葉提取物對(duì)水稻稻瘟病菌和小麥赤霉病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性。這說明在該提取物中存在一類或幾類可抑制相關(guān)農(nóng)業(yè)真菌病害的物質(zhì)，提示其可能在農(nóng)用殺菌劑方面具有一定的開發(fā)潛力。因此，厘清枸骨提取物中具體的農(nóng)藥活性成分和及其作用機(jī)理，將有助于綠色防控植物真菌病害和發(fā)掘生態(tài)環(huán)境友好型農(nóng)藥分子。