靶向調控AQP4對非小細胞肺癌細胞化療敏感性的調控作用

郭守俊，謝傳華，黃萍，邱伊連，王碩，班振英，張威

肺癌作為呼吸系統常見的惡性腫瘤，已位于世界腫瘤死亡順位之首［1］，其發病率正呈現逐年上升趨勢［2］。根據病理學特征及臨床特點，肺癌可分為非小細胞癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類。在我國，每年約有60 萬患者死于肺癌，其中NSCLC 患者所占比例達到80%以上［3］。很多NSCLC患者在診斷時已為晚期，喪失了手術機會，需要進行化療。目前，對化療藥物產生耐藥性成為NSCLC治療失敗的主要原因，大大降低了化療應有的效果且嚴重限制了化療在臨床上的應用。因此，基因靶向治療聯合化療以增加化療敏感性成為NSCLC 治療的研究熱點。

水通道蛋白（Aquaporin，AQPs）是一種與水分子運輸相關的跨膜蛋白，廣泛分布于人體的各種組織中，在跨細胞和跨上皮水運輸中起主要作用。在哺乳動物中，已經鑒定出13個水通道蛋白基因家族成員（AQP0～AQP12）［4］。近年來，大量研究證據表明，AQPs與癌癥生物學功能密切相關，并在二十多種人類癌細胞中都有表達［5］，AQPs 的表達與腫瘤的類型、等級、增殖、遷移及血管生成均相關［6-7］，被認為是抗癌治療的靶標。目前化療藥物發生耐藥的機制尚未明確，NSCLC組織中存在AQP4 基因的過表達是否與其化療耐藥有關，靶向調控AQP4 基因能否增強對NSCLC細胞的化療敏感性，國內尚鮮見相關報道。本研究擬探討AQP4在NSCLC化療敏感性中的作用及其可能的機制，以評估AQP4 作為NSCLC治療的新靶點的價值，為提高NSCLC對化療藥物的敏感性提供更多實驗證據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備 人NSCLC A549 細胞以及順鉑耐藥株A549/DDP購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。RPMI 1640 培養液和胎牛血清購自美國Hyclon公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自南京碧波生物有限公司。反轉錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自日本 TaKaRa 公司；PCR 引物以及 siRNA 為廣州瑞博生物科技有限公司設計合成。兔抗人AQP4、P53、Bcl-2、β-actin抗體購自Abcam公司。

二氧化碳恒溫培養箱購于美國Thermo Forma公司；熒光倒置相差顯微鏡和照相系購于統日本Olympus 公司；FACS Aria 流式細胞儀購于美國BD 公司；低溫高速離心機購于德國Heraeus 公司；凝膠電泳儀購于美國Bio-Rad 公司；紫外線分光光度儀購于德國Ependorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組和轉染 肺癌細胞A549和A549/DDP使用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱內孵育，隔天更換培養液。首先將細胞分為 A549組和 A549/DDP組，檢測 AQP4 在 2 種不同細胞中的表達情況。設計靶向AQP4的siRNA，轉染到A549/DDP細胞中，依據轉染物的不同分為轉染組（siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-NC組）和空白對照組（A549/DDP組）。篩選出最優的siRNA后進行進一步的研究。

設計合成的 siRNA 序列：AQP4 siRNA-1 為 5'-GCTCAATAGCTTTAGCAATTG-3'，AQP4 siRNA-2 為 5' -GGUCUCCUGGUAGA GUUGAUAAUCA-3'，對照序列siRNA-NC 為 5'-GGUCCGUUGGAGAUUAGAUAUCUCA-3'。當細胞融合率達70%～80%時進行轉染，按照LipofectamineTM2000 試劑盒說明書提供的方法分別將siRNA 或siRNA-NC轉染入A549/DDP細胞，用不含siRNA只加入脂質體的A549/DDP細胞作為空白對照（A549/DDP組）。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測各實驗組細胞中AQP4 mRNA的表達 收集細胞，使用Trizol法抽提各組細胞mRNA。分光光度計分析A260/A280計算RNA 總濃度。采用TaKaRa Prime ScriptTMreagent Kit 反錄試劑盒將mRNA 逆轉錄成cDNA；以此cDNA 為模板采用實時熒光定量PCR 儀（7500 Fast）進行擴增，擴增體系為：SYBR premix Ex Taq Ⅱ10 μL、cDNA 2 μL、引物1μL、焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate，DEPC）處理水7μL。引物序列為AQP4上游引物：5'-CATGGAGGTGGAGGACAA-3'；AQP4下游引物：5'-TGGGTGGAAGGAAATCTG-3'，長度206 bp。GAPDH上游引物：5'-AAATCCCATCACCATCTTCCAG-3'；GAPDH下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTG-3'，長度310 bp。qRT-PCR 的反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 變性40 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共進行40個循環。以GAPDH的拷貝數作為內參基因，采用2-ΔΔCt法分析結果。

1.2.3 Western blot 檢測各組細胞蛋白的表達 轉染細胞48 h 后，依據實驗分組，提取各組細胞總蛋白，采用BCA（bicinchoninic acid）法進行蛋白定量。制備電泳凝膠，每孔加50μg 蛋白，采用SDS-PAGE 電泳將蛋白進行分離。采用半干法電轉移到PVDF膜上。用牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉2 h，加入一抗（AQP4 1∶500，P53 1∶1 000，Bcl-2 1∶1 000，β-actin 1∶1 000）4 ℃孵育過夜。用TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次5 min。用辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育 1 h。用TBST 溶液漂洗PVDF 膜3次，每次5 min。采用ECL AdvanceTM試劑盒顯色，X光片曝光成像。β-actin作為內參基因。

1.2.4 CCK-8 檢測細胞增殖能力和藥物敏感性 收集對數生長期的細胞，實驗前24 h 以1 500/孔接種在96 孔板中，根據實驗分組轉染siRNA，每組設立6個復孔，同時設立空白對照孔。在轉染后 24、48、72 h 后吸走培養基，PBS 洗后加入CCK-8反應液，放入培養箱繼續培養2 h后，于酶標儀上測定450 mm波長處各孔的吸光度（OD）值。繪制細胞生長曲線。

檢測細胞藥物敏感性變化：細胞接種到96孔板上，轉染siRNA 24 h 后更換含有順鉑（DDP）的完全培養基，DDP 的濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L。繼續培養48 h后CCK-8法檢測細胞存活率，計算細胞存活率及各組細胞的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值。

1.2.5 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡能力 將轉染后48 h各組細胞消化成單細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清收集細胞，PBS 重懸后取2×105個細胞。加5μL Annexin VFITC到細胞懸液中，再加5μL碘化丙啶，混勻后避光孵育15 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，在30 min 中檢測完成。

1.3 統計學方法 數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件完成，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，2組間比較采用t檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 A549/DDP細胞與A549細胞中 AQP4 的表達 qRT-PCR 檢測結果顯示，耐藥細胞珠A549/DDP 中AQP4 mRNA的相對表達量為（1.747±0.097），親本細胞株 A549 中 AQP4 mRNA 的相對表達量為（0.975±0.083），2組比較差異有統計學意義（n=6，t=14.788，P＜0.01）。Western blot 分析結果顯示，A549/DDP 細胞中AQP4 蛋白相對表達量為（0.797±0.070），顯著高于A549 細胞中AQP4 蛋白表達量（0.545±0.099），差異有統計學意義（n=6，t=5.085，P＜0.01）。見圖1A。通過將AQP4 siRNA 轉染到A549/DDP細胞中后，siRNA-1組和siRNA-2組AQP4 mRNA 和蛋白表達量與對照組相比均顯著下降，見圖1B、表1，這提示AQP4 siRNA 能夠使AQP4的表達沉默。進一步比較發現siRNA-2組AQP4 mRNA 和蛋白表達量低于siRNA-1組（P＜0.01），因此選擇使用siRNA-2作為后續研究的干擾序列。

Fig.1 Western blot analysis of AQP4 protein expressions圖1 Western blot 檢測AQP4蛋白的表達

2.2 AQP4 表達沉默后對A549/DDP 細胞增殖和凋亡的影響 將AQP4 siRNA 轉染到A549/DDP 細胞后，siRNA-2組細胞增殖能力較A549/DDP組和siRNA-NC組均顯著降低，在 48 h、72 h 比較差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。流式細胞術結果顯示，轉染 AQP4 siRNA 48 h 后，siRNA-2組細胞凋亡率為（12.24±1.55）%，顯著高于A549/DDP組（3.01±0.81）%和siRNA-NC組（3.31±0.98）%，差異有統計學意義（n=6，F=123.145，P＜0.01），見圖2。

Tab.1 The effect of siRNA transfection on the expression level of AQP4 in A549/DDP cells表1 siRNA轉染A549/DDP細胞后對AQP4表達的影響（n=6，±s）

Tab.1 The effect of siRNA transfection on the expression level of AQP4 in A549/DDP cells表1 siRNA轉染A549/DDP細胞后對AQP4表達的影響（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a 與 A549/DDP組比較，b 與 siRNA-NC組比較，c 與siRNA-1組比較，P＜0.05

組別mRNA 蛋白A549/DDP組siRNA-NC組siRNA-1組siRNA-2組F 0.985±0.047 0.975±0.083 0.425±0.051ab 0.385±0.037abc 201.505＊＊0.600±0.100 0.608±0.107 0.405±0.061ab 0.330±0.064abc 16.012＊＊

Tab.2 The effect of siRNA transfection on cell proliferation of A549/DDP cells表2 siRNA轉染后對A549/DDP細胞增殖能力的影響（n=6，OD，±s）

Tab.2 The effect of siRNA transfection on cell proliferation of A549/DDP cells表2 siRNA轉染后對A549/DDP細胞增殖能力的影響（n=6，OD，±s）

＊＊P＜0.01；a與A549/DDP組比較，b與siRNA-NC組比較，P＜0.01

組別A549/DDP組siRNA-NC組siRNA-2組F 24 h 0.40±0.07 0.39±0.06 0.34±0.03 1.855 48 h 0.74±0.10 0.71±0.13 0.47±0.07ab 12.842＊＊72 h 1.26±0.11 1.22±0.12 0.64±0.05ab 72.217＊＊

2.3 AQP4 表達沉默后A549/DDP 細胞對化療藥物的敏感性 將AQP4 siRNA 轉染到A549/DDP 細胞后，siRNA-2組 IC50值為（28.65±6.51）μmol/L，與A549/DDP組的（54.30±5.01）μmol/L和siRNA-NC組的（50.35±7.75）μmol/L 相比明顯降低，細胞對順鉑的敏感性明顯增加，組間比較差異有統計學意義（n=6，F=26.918，P＜0.01）。

2.4 AQP4 表達沉默對凋亡蛋白的調節作用 使AQP4基因表達沉默后，siRNA-2組細胞中P53蛋白相對表達量為（0.945±0.091），較 A549/DDP組（0.478±0.091）和siRNA-NC組（0.465±0.078）相比明顯升高，組間比較差異有統計學意義（n=6，F=59.736，P＜0.01）。siRNA-2組細胞中Bcl-2 蛋白相對表達量為（0.293±0.093），較A549/DDP組（0.527±0.064）和siRNA-NC組（0.545±0.047）相比明顯降低，組間比較差異有統計學意義（n=6，F=23.745，P＜0.01）。見圖3。

3 討論

AQPs促進水分子跨上皮細胞的轉運，并在人體呼吸道的正常生理和相關疾病的發展過程中發揮重要作用。在人的肺部和氣道中至少表達4種AQPs：微血管內皮中的AQP1，氣道上皮中的AQP3 和AQP4，以及Ⅰ型肺泡上皮細胞、黏膜下腺泡和氣道上皮細胞中的AQP5，這幾種AQPs 與人體的肺水轉運密切相關［8-9］。近年來，越來越多的研究表明，AQPs 在許多不同組織來源的腫瘤細胞中得以表達并增強了腫瘤細胞的遷移和轉移潛能［10-12］，提示抑制AQPs表達可作為抑制腫瘤擴散的可能策略［13］。

Fig.2 The effect of siRNA transfection on apoptosis of A549/DDP cells detected by AnnexinV-FITC/PI double marker flow cytometry圖2 流式細胞術檢測siRNA轉染后對A549/DDP細胞凋亡能力的影響

Fig.3 The effect of AQP4 siRNA transfection on expressions of P53 and Bcl-2 in A549/DDP cells圖3 AQP4轉染A549/DDP細胞后對P53和Bcl-2 蛋白表達的影響

肺癌是目前全球范圍內常見的高發病率及高死亡率的惡性腫瘤，NSCLC是最常見的肺癌類型，由于其早期診斷較為困難，大多數病例在明確診斷時已經是中晚期，從而錯失最佳手術治療的適應證。雖然含順鉑的聯合化療法在一定程度上改善了NSCLC晚期的治療情況，但對化療藥物產生固有耐藥或獲得性耐藥的幾率較高，給NSCLC的臨床治療造成困難。腫瘤細胞產生耐藥的機制并不清楚。已有研究表明，細胞的水通透性影響順鉑藥物的敏感性，AQP1、AQP3和AQP8的表達與卵巢癌的化療敏感性密切相關［14］。石曉明等［15］及楊明利等［16］的研究結果顯示，沉默AQP5及過表達AQP8均可以提高結腸癌細胞對DDP 的敏感性。AQP4已被證實在NSCLC組織中存在過表達，并對NSCLC細胞的增殖遷移產生重要影響。本研究則致力于探索AQP4對NSCLC細胞化療敏感性的影響，結果顯示，在耐藥株A549/DDP 中AQP4 呈高表達，因此筆者推斷在NSCLC 細胞中AQP4的表達異常與化療藥物的敏感性存在一定的相關性，通過對AQP4 的表達調控有可能提高NSCLC細胞對DDP的敏感性。

本研究設計了靶向AQP4 的siRNA，通過siRNA使A549/DDP 細胞中AQP4 表達沉默，發現A549/DDP細胞的增殖能力降低，凋亡率升高，同時細胞對DDP 的敏感性提高，這提示通過對AQP4 表達靶向調控，可對NSCLC 的細胞增殖、凋亡以及耐藥性產生影響。研究還發現APQ4表達沉默后，Bcl-2蛋白表達降低，P53 蛋白表達升高，提示AQP4 可能通過對P53和Bcl-2的調控從而對細胞的凋亡產生影響。研究表明Bcl-2 蛋白能夠通過線粒體介導途徑導致起細胞凋亡［17］，P53作為Bcl-2基因轉錄的負調控因子，也參與了細胞凋亡的過程［18］。因此AQP4 表達沉默后可能導致細胞凋亡途徑的激活，導致細胞凋亡和壞死，從而對NSCLC細胞耐藥性產生影響。

綜合過去多項研究，腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥的機制是多方面的：藥物在細胞內外的異常轉運；藥物活性的改變；對DNA 損傷的耐受性或修復能力的增加等。AQPs 在調節細胞水通透性中起重要作用，是細胞對外界滲透壓做出改變的主要途徑，研究證實，細胞外高滲透壓環境能誘導細胞內AQPs表達改變［19］。也有研究報道，AQPs表達增加能夠使腫瘤細胞產生藥物抗性［20］，這些證據都在一定程度上支持了本次的研究結果。AQP4 在參與肺部水分子運輸過程中，可能會在在藥物跨膜轉運、細胞通透性改變等方面對NSCLC 細胞的化療敏感性產生影響，其具體作用機制尚需進一步研究。

綜上，通過靶向調控AQP4，抑制A549 細胞中AQP4的表達可以有效增加A549細胞對化療藥物的敏感性，對AQP4 與化療敏感性的深入研究將為NSCLC 的化學治療提供新的切入點，為靶向治療與化療聯合的腫瘤治療方法提供一定的理論基礎，AQP4可能成為NSCLC治療中新的潛在靶點。