商陸皂苷甲對MRL/lpr小鼠iTr35細胞及其相關細胞因子表達的影響

王幸，曾慧林，張祥貴，湯杰印

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）嚴重并發癥之一，也是其死亡的主要原因。目前認為LN的發病主要是腎臟細胞增殖與凋亡失衡（表現為增殖過度，凋亡不足）所致［1］。商陸皂苷甲（esculentoside A，EsA）是從中藥商陸中提取出的主要成分之一，具有抗炎、免疫調節、抑制細胞增殖和促凋亡的作用［2］。課題組前期研究發現EsA 能顯著改善LN 小鼠的尿蛋白及腎臟病理表現，隨后對其機制進行探討，發現EsA 可抑制輔助性 T 細胞 17（T helper cell 17，Th17）的分化，從而降低白細胞介素（IL）-17 的表達，抑制IL-17 誘導的腎小球系膜細胞增殖［3-7］。iTr35（CD4+Foxp3-IL-12p35+IL-27EBI3+）細胞是最新發現的調節性T細胞亞群，由IL-35誘導人或小鼠初始T細胞轉變而成，具有強大的免疫抑制功能［8-9］，通過分泌特征性細胞因子IL-35發揮作用。IL-35是IL-12家族成員之一，由p35 亞基和EB 病毒誘導基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3，EBI3）亞基組成的異源二聚體（IL-12p35/IL-27EBI3），在體內外均可抑制 Th17 細胞的分化，減少 IL-17 的分泌［10-11］。課題組前期體外實驗發現EsA 對IL-17 有抑制作用，因此，本次實驗以MRL/lpr 狼瘡腎炎模型小鼠為研究對象，觀察EsA 對MRL/ipr 小鼠體內IL-35、IL-17及iTr35表達的影響，從體內實驗進一步證實EsA對IL-17的作用，明確EsA對IL-17的抑制是否通過IL-35來調節。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）實驗動物。16周齡雌性MRL/lpr小鼠24只，體質量（25±2）g，由美國Jackson 實驗室提供，動物許可證：SCXK（蘇）2016-0010。（2）藥品與試劑。商陸皂苷甲（純度＞98%，編號SE8230）、HE 染色試劑盒（編號G1120）、Masson 染色試劑盒（編號G1345）購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI 1640 培養液（編號TBD724000）購自武漢華聯科生物技術有限公司；IL-12p35單克隆抗體（編號MAB1570）購自R & D公司；尿蛋白檢測試劑盒（編號CO35-2）、肌酐測定試劑盒（編號CO11-2）購自南京建成生物科技有限公司；IL-35酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（編號MU33024）、IL-17 ELISA 試劑盒（編號MU30074）購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；APC anti-mouse CD4（編號110412）購自BioLegend公司；Anti-Mouse FOXP3 FITC（編號8341250100）購自Biogems公司；IL-12 p35 單克隆抗體FITC（編號MA5-23683）、IL-27單克隆抗體PE（編號MA5-23651）購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 取16周齡MRL/lpr小鼠24只，采用隨機數字表法將小鼠分為模型對照組、EsA組和EsA+IL-12p35抗體組，各8只。模型對照組每日腹腔注射RPMI 1640培養液 0.2 mL，共 4 周；EsA組腹腔注射 EsA 溶液（20 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，共 4 周；EsA+IL-12p35 抗體組腹腔注射 EsA溶液（20 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，共4周，在首次注射EsA溶液后注射IL-12 p35 抗體（2.5 mg/kg）1 次。所有小鼠在 SPF 條件下的獨立通風籠中飼養，室內溫度、濕度恒定，定期更換無菌籠具、墊料和飲用水等。根據體質量調整飲食量，自由進水。

1.2.2 尿蛋白/肌酐值檢測 實驗結束后用按壓膀胱法收集尿液，考馬斯亮藍（CBB）法檢測尿蛋白濃度、肌氨酸氧化酶法檢測尿肌酐濃度，計算尿蛋白/肌酐比值。

1.2.3 血肌酐檢測 實驗結束后，采用眼球摘除法收集血液，靜置4 h，1 500 r/min 離心15 min，取上清，備用。采用肌氨酸氧化酶法檢測血肌酐濃度，用酶標儀測定各樣本波長546 nm處光密度（OD）值A1和A2，將A1、A2帶入公式計算肌酐濃度=［（測定A2-K×測定A1）-（空白A2-K×空白A1）］×標準品濃度/［（標準A2-K×標準A1）-（空白A2-K×空白A1）］，其中稀釋因子K=186/246，具體步驟參照說明書進行。

1.2.4 血清IL-35、IL-17檢測 采用ELISA方法檢測小鼠血清IL-35、IL-17，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 流式細胞術檢測外周血iTr35細胞比例 采用全血計數法，將小鼠全部處死后取外周血，經體外刺激［丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）20μg/L、離子霉素（Ionomycin）1 mg/L］，2μmol/L莫能菌素（Monensin）作為蛋白轉運抑制劑，37 ℃、5%CO2下孵育6 h，以CD4-APC和Foxp3-FITC設門，固定、破膜，經IL-12p35-FITC、IL-27EBI3-PE 抗體染色 30 min，檢測 CD4+Foxp3-IL-12p35+IL-27EBI3+（iTr35）細胞比例，染色結束后，上流式分析儀進行流式檢測，使用Flow Jo軟件進行分析。

1.2.6 腎臟病理染色 小鼠處死后，提取腎組織，固定12 h后，脫水、常規石蠟包埋、切片，厚度為4μm，進行HE、Masson染色，觀察腎臟病理改變情況。

1.3 統計學方法 應用SPSS 21.0 統計軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組樣本均數間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠尿蛋白/肌酐值、血肌酐、IL-35、IL-17水平比較 3組小鼠尿蛋白/肌酐值、血肌酐濃度、IL-35及IL-17均有不同程度的改變，其中模型對照組尿蛋白/肌酐值、血肌酐濃度及IL-17含量最高，其次為EsA+IL-12p35抗體組，EsA治療組小鼠含量最低（P＜0.05）；模型對照組IL-35 含量最低，其次為EsA+IL-12p35 抗體組，EsA 治療組小鼠 IL-35 含量最高（P＜0.05），見表1。

2.2 各組小鼠外周血iTr35細胞比例比較 與模型對照組（0.064%±0.041%）相比，EsA組（0.398%±0.077%）小鼠外周血iTr35 細胞比例明顯升高（P＜0.05）；經IL-12p35抗體干預后，EsA+IL-12p35抗體組iTr35 比例（0.140%±0.027%）較EsA組下降，但仍高于模型對照組（n=8，F=87.695，P＜0.01），見圖1。

2.3 各組腎臟病理表現 模型對照組小鼠腎臟病理特點為腎小球系膜細胞及系膜基質增生，毛細血管腔被增生的細胞填滿，毛細血管腔閉塞，符合彌漫增生性腎小球腎炎病理改變；此外腎小球周圍可見大量炎性細胞浸潤，部分可見腎小球硬化及新月體形成。經 EsA 治療后，EsA組和 EsA+IL-12p35 抗體組系膜增生有所減輕，毛細血管開放增多，炎細胞浸潤減少，2組小鼠均未見新月體形成，3組間腎小管無明顯變化，見圖2。

Tab.1 Comparison of the urine protein/urine creatinine,serum levels of creatinine concentration,IL-35 and IL-17 between the three groups表1 各組MRL/lpr小鼠治療后尿蛋白/肌酐值、血肌酐濃度、IL-35及IL-17水平比較 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of the urine protein/urine creatinine,serum levels of creatinine concentration,IL-35 and IL-17 between the three groups表1 各組MRL/lpr小鼠治療后尿蛋白/肌酐值、血肌酐濃度、IL-35及IL-17水平比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與模型對照組比較，b與EsA組比較，P＜0.05

組別模型對照組EsA組EsA+IL-12p35抗體組F尿蛋白/肌酐值（mg/g）18.89±0.93 12.17±1.47a 13.50±0.92ab 78.808＊＊血肌酐（μmol/L）69.81±12.64 22.94±6.25a 36.28±3.48ab 66.287＊＊IL-35（ng/L）116.70±14.03 142.19±6.34a 130.17±12.70ab 9.798＊＊IL-17（ng/L）17.71±1.83 12.76±1.31a 14.64±1.85ab 17.607＊＊

Fig.1 Proportion of iTr35 detected by flow cytometry in three groups圖1 流式細胞術檢測iTr35在各組中的比例

Fig.2 Pathological changes of renal tissues in three groups of mice(×400)圖2 各組小鼠腎組織病變情況（×400）

3 討論

3.1 EsA 對MRL/lpr 小鼠尿蛋白、血肌酐的影響 SLE 是一種以產生自身抗體為特征，從而導致多器官損害的自身免疫性疾病，腎臟是主要受累器官之一，腎功能惡化是引起病情進展及死亡的重要因素。SLE 患者體內存在T 淋巴細胞功能失調，以致抗原不斷出現，并在CD4+T 細胞的刺激下引起B細胞持續活化，產生自身抗體，與抗原結合后形成免疫復合物，通過血液循環沉積于腎臟，導致LN 的發生。因此，調節T細胞亞群的紊亂、減少自身抗體的產生對改善LN患者的預后具有重要意義。MRL/lpr小鼠是自發性系統性紅斑狼瘡小鼠模型之一，最早8 周發病，16 周出現以嚴重蛋白尿為特征的腎功能退化，50%小鼠于24 周死亡，其發病無性別優勢［12-13］。為此，我們選取 16 周齡的雌性 MRL/lpr 小鼠為研究對象，20 周齡為實驗終點符合實驗需要。尿蛋白是評估腎臟病變的重要指標，本實驗隨機尿蛋白/肌酐值是臨床上尿蛋白定量檢測方法之一，具有快速、簡便、精確等優點，能夠可靠地反映并替代傳統的24 h尿蛋白定量檢測。治療終點對3組小鼠進行尿蛋白/肌酐值、血肌酐濃度檢測發現，與模型對照組相比，EsA治療組小鼠尿蛋白/肌酐值、血肌酐濃度明顯下降，經IL-12p35 抗體阻斷后，EsA+IL-12p35 抗體組尿蛋白/肌酐值、血肌酐濃度下降程度不及EsA 治療組，3組尿蛋白/肌酐值及血肌酐濃度水平與既往研究結果相近［14-16］。上述結果說明EsA可減少MRL/lpr 小鼠尿蛋白及血肌酐濃度，改善腎功能，經IL-12p35 抗體阻斷后，由于IL-35 合成減少，導致其療效減弱，使得兩指標濃度較EsA組上升，推測EsA 對MRL/lpr 小鼠的治療療效可能與IL-35有關。

3.2 EsA對MRL/lpr小鼠外周血IL-35、IL-17、iTr35表達的影響 IL-35是新近發現的抑制性細胞因子，參與多種自身免疫性疾病的發病，在體內外均可抑制炎性細胞因子IL-17的表達。iTr35是IL-35誘導人或小鼠初始T細胞轉化而成的一種具有較強免疫抑制功能的、且不依賴FOXP3 的新型FOXP3-Treg，即“iTr35 細胞”，通過分泌IL-35 發揮免疫抑制作用［17］。本研究結果表明，MRL/lpr 小鼠存在 IL-35、IL-17 數量及外周血iTr35 細胞比例的異常，模型對照組小鼠IL-35 表達水平和外周血iTr35 細胞比例最低，而IL-17水平最高，經EsA治療后，EsA組小鼠的 IL-35 水平及 iTr35 細胞比例明顯上升，IL-17 則顯著減少，說明EsA可上調IL-35表達，誘導iTr35生成，抑制IL-17的分泌。為了觀察EsA對IL-17的抑制是否通過IL-35 調控，筆者用IL-12p35 抗體阻斷IL-35 的合成，發現EsA+IL-12p35 抗體組小鼠血清IL-35 表達較EsA組減少，但仍高于模型對照組，此時IL-17水平較EsA組增加，說明EsA對IL-17的抑制作用可通過IL-35來調控。

3.3 EsA 對MRL/lpr 小鼠腎臟病理改善情況 腎臟病理是診斷狼瘡性腎炎及分型的“金標準”。本研究發現，3組小鼠腎臟病理表現存在不同程度的改變，其中模型對照組腎臟病變最為嚴重，主要表現為腎小球系膜細胞增生，經EsA治療后，其病理表現可得到一定的改善，進一步證實了EsA 對狼瘡性腎炎的治療作用。

綜上所述，EsA 可顯著改善LN 小鼠模型尿蛋白、血肌酐及腎臟病理情況，其機制可能與上調IL-35表達、誘導iTr35細胞生成有關。但其中的因果關系并不明確，可能存在3種情況：一是EsA直接上調IL-35的表達，IL-35誘導iTr35分泌，從而導致iTr35增多；二是EsA 誘導iTr35 細胞的生成，iTr35 再分泌更多的IL-35發揮作用；三是EsA可對IL-35及iTr35均產生作用，EsA對兩者的調控機制如何，還需進一步實驗研究證實。但可以肯定的是，EsA可通過IL-35 調控IL-17，進而發揮藥理作用，減少IL-17 的分泌，減輕炎癥反應，緩解LN的病情。