機械加載對大鼠薄型子宮內膜的修復作用

田甜，劉大全，2，李心樂，邵珩，張平，2△

薄型子宮內膜是指子宮內膜的厚度低于能夠獲得妊娠的閾厚度［1］。過度刮宮、內分泌失調、宮腔粘連等多種因素可導致子宮內膜變薄，影響子宮內膜容受性，導致體外受精-胚胎種植（IVF-ET）失敗，增加流產的風險，不能維持妊娠，是目前生殖醫(yī)學界的一大難題［2］。Miwa等［3］研究表明薄型子宮內膜的主要特征為子宮動脈血流高阻力、腺上皮生長受限、血管內皮生長因子（VEGF）低表達和血管發(fā)育不良。針對這一難題，臨床上常以大劑量雌激素治療為主，加以其他輔助性治療藥物如阿司匹林、枸櫞酸氯米芬及維生素E等，但效果并不理想，甚至有些患者對藥物治療無反應［4］。機械加載能夠在一定程度上模擬人體主動運動，以一定的加載頻率對膝關節(jié)等滑膜關節(jié)進行機械刺激，引起機體合成代謝反應。本課題組前期研究顯示，在股骨頭壞死的動物模型中，機械加載可通過上調VEGF 的表達促進血管生成，同時增加血液灌注以加強股骨頭血管重塑和骨傷口的愈合［5］。但有關機械加載對受損子宮內膜的修復作用尚不清楚。本研究通過建立乙醇誘導的薄型子宮內膜動物模型，初步探討機械加載對薄型子宮內膜的修復作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30 只雌性 SD 大鼠，SPF 級，10～12 周齡，體質量約220～250 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院動物中心提供。所有實驗動物的飼養(yǎng)和管理遵守天津醫(yī)科大學實驗動物管理規(guī)定，本研究經天津醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑及儀器 95%乙醇購自天津致遠化學試劑公司。青霉素購自美國Invitrogen 公司。蘇木素-伊紅（HE）染色液購自北京索萊寶公司。細胞增殖核抗原（Ki-67）一抗購自美國Abcam 公司。VEGF 一抗購自武漢Proteintech 公司。二抗（生物素標記山羊抗兔抗體）、磷酸鹽緩沖液（PBS）及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）等其他化學品購自北京中杉金橋生物有限公司。石蠟切片機購自德國Leica公司產品。光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。機械加載治療儀器為本課題組自主研發(fā)（中國專利號：ZL 2016 2 1010131.9）。

1.2 方法

1.2.1 陰道涂片 動物適應性喂養(yǎng)1周后開始進行實驗。每日上午8：00—9：00做大鼠陰道涂片檢查。用蘸有生理鹽水的棉拭子取出陰道分泌物涂在玻片上，自然干燥后在顯微鏡下直接觀察。或者玻片干燥后用95%乙醇固定后進行常規(guī)HE染色。通過鏡下觀察陰道脫落細胞形態(tài)學變化確定大鼠動情周期的各階段，并詳細記錄變化規(guī)律。

1.2.2 動物分組 采用隨機數字表法將30只大鼠分成假手術組（Sham組），薄型子宮內膜模型組（TE組）和機械加載治療組（TE+L組），每組10 只。Sham組宮腔注射生理鹽水，TE組宮腔注射95%乙醇建立薄型子宮內膜模型，TE+L組造模次日接受機械加載治療，連續(xù)治療3個動情周期即15 d。

1.2.3 模型制備 取處于動情期的雌性SD 大鼠，2.5%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定，正中逐層切開腹部，暴露一側子宮，用0號縫合絲線活結結扎子宮兩端，見圖1。用1 mL注射器將0.3 mL 的95%乙醇緩慢注入宮腔內，保持宮腔充盈狀態(tài)，2 min 后再注射0.1 mL，連續(xù)2 次，另一側子宮同樣處理。反復沖洗宮腔，恢復子宮解剖位置，逐層關腹縫合［6］。對于Sham組，宮腔注入等量的生理鹽水。術后連續(xù)肌內注射青霉素（80萬U/只）3 d，預防感染。

Fig.1 The schematic diagram of uterine exposure and ligation in rats圖1 大鼠子宮暴露和結扎圖示

1.2.4 機械加載治療 2%異氟烷以1.0～1.5 L/min 的流速對TE+L組大鼠誘導麻醉后，采用本課題組自主研發(fā)的小動物關節(jié)機械加載治療儀進行治療。將大鼠膝關節(jié)外側、內側置于加載桿和定子之間，加載力由外側向內側施加到關節(jié)上，見圖2。加載頻率為15 Hz，力度為5 N，時間為5 min/d［5］，連續(xù)治療3個動情周期即15 d。Sham組和TE組大鼠用相同的方法被麻醉和固定，但不接受機械加載治療。

Fig.2 The schematic diagram of mechanical loading for rats圖2 大鼠機械加載圖示

1.2.5 病理組織形態(tài)學觀測 3組動物子宮組織取材后，標本經4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，5μm組織切片。每只大鼠分別取3 張切片進行常規(guī)HE 染色，光學顯微鏡下觀察子宮內膜組織病理形態(tài)學改變，采用OLYMPUS cell Sens Standard 圖像處理軟件測定子宮內膜厚度（子宮內膜肌層交接處至宮腔的垂直距離）和子宮內膜面積。此外，在40倍鏡下計數視野內子宮內膜腺體的數目。

1.2.6 免疫組織化學法檢測子宮組織VEGF 和Ki-67 的表達 石蠟切片經37 ℃烘片過夜，梯度乙醇水化，PBS 沖洗3 min×3次，微波抗原修復3 min×2次。每張切片滴加3%H2O2室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次。封閉用血清工作液孵育15 min，甩去切片表面的封閉液（勿洗）。滴加稀釋好的一抗（VEGF和Ki-67稀釋濃度均是1∶200）4 ℃過夜，PBS沖洗3 min×3 次。滴加二抗工作液孵育15 min，PBS 沖洗3 min×3次。辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液孵育15 min，PBS 沖洗 3 min×3 次，DAB 顯色，自來水沖洗 3 min。蘇木素復染15 min，PBS 返藍4 min，梯度乙醇水化，中性樹膠封片。VEGF 和Ki-67 蛋白表達分別位于細胞質和細胞核中，呈現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細胞。每張切片隨機選擇5個400倍視野，計算視野內VEGF 和Ki-67 陽性表達率=陽性細胞數/觀察細胞數×100%，分別反映子宮內膜血管生成和細胞增殖情況［7-8］。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 進行數據統(tǒng)計的處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠動情周期各階段的陰道涂片 動情前期陰道涂片主要為圓形或橢圓形的有核上皮細胞，偶有少量角化上皮細胞；動情期多為無核角化上皮細胞，外形不規(guī)則呈落葉狀聚集分布；動情后期小而圓的白細胞開始增多，有核上皮細胞和無核角化細胞同時存在，并且比例無明顯的差異；動情間期陰道涂片的主要特征是白細胞，見圖3、4。

2.2 機械加載對子宮內膜組織病理學變化的影響 HE染色結果顯示，Sham組子宮內膜結構完整，呈波浪形，腺上皮及腔上皮細胞形態(tài)正常，排列緊密呈單層立方狀，間質無水腫，血管和腺體正常。與Sham組相比，TE組子宮壁全層變薄，子宮內膜層最顯著，宮腔內可見脫落的組織碎片，子宮內膜結構有缺失不連續(xù)，腺上皮及腔上皮細胞多呈現(xiàn)扁平狀，腺體明顯減少，間質部分水腫，血管分布稀疏。經過機械加載治療后，TE+L組子宮可見大部分完整宮腔結構，內膜有一定的波浪形，大部分腺上皮及腔上皮細胞完整，分布均勻，排列緊密呈單層立方狀，腺體增多，血管分布密度集中，病理變化與TE組相比明顯改善，見圖5。

2.3 機械加載對子宮內膜厚度、子宮內膜面積和腺體數目的影響 與Sham組相比，TE組子宮內膜明顯萎縮變薄，子宮內膜面積減少，腺體數目顯著下降（均P＜0.05）。與TE組相比，TE+L組子宮內膜的厚度明顯增厚，子宮內膜面積增加，腺體數目顯著增多（均P＜0.05），見表1。

2.4 機械加載對子宮內膜中VEGF表達的影響 免疫組化VEGF染色結果顯示，VEGF主要表達在子宮內膜上皮細胞和間質細胞胞質中；與Sham組相比，TE組VEGF在子宮內膜上皮細胞和間質細胞中的陽性表達率明顯降低（P＜0.05），經機械加載治療后，TE+L組VEGF 在子宮內膜上皮細胞和間質細胞中的陽性表達率較TE組顯著升高（P＜0.05），見圖6、表2。

Fig.5 Morphological changes of rat endometrium（HE staining）圖5 大鼠子宮內膜的形態(tài)學變化（HE染色）

Tab.1 Comparison of endometrial thickness,endometrial area and gland number between three groups表1 各組子宮內膜厚度、子宮內膜面積和腺體數目的比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of endometrial thickness,endometrial area and gland number between three groups表1 各組子宮內膜厚度、子宮內膜面積和腺體數目的比較（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與TE組比較，P＜0.05

組別Sham組TE組TE+L組F子宮內膜厚度（μm）535.84±61.23 245.13±51.62a 321.82±59.19ab 68.679＊子宮內膜面積（mm2）1.78±0.48 0.76±0.19a 1.09±0.21ab 25.666＊腺體數目（個）20.10±6.21 4.50±1.27a 8.10±1.29ab 47.872＊

2.5 機械加載對子宮內膜中Ki-67表達的影響 免疫組化Ki-67染色結果顯示，Ki-67主要表達在子宮內膜腺上皮細胞和間質細胞胞核中；與Sham組相比，TE組Ki-67 在腺上皮細胞和間質細胞中的陽性表達率明顯降低（P＜0.05）。經機械加載治療后，TE+L組Ki-67 在腺上皮細胞和間質細胞中的陽性表達率較TE組顯著升高（P＜0.05），見圖7、表2。

Tab.2 Comparison of positive expressions of VEGF and Ki-67 in endometrium between three groups表2 各組子宮內膜中VEGF和Ki-67陽性表達率的比較（n=10，%，±s）

Tab.2 Comparison of positive expressions of VEGF and Ki-67 in endometrium between three groups表2 各組子宮內膜中VEGF和Ki-67陽性表達率的比較（n=10，%，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與TE組比較，P＜0.05

組別Sham組TE組TE+L組F VEGF 39.61±11.03 20.59±4.58a 27.63±5.42ab 16.125＊Ki-67 25.72±6.11 12.48±3.88a 18.43±3.83ab 19.643＊

3 討論

近年來，不孕癥已成為困擾女性生殖健康的世界性問題，輔助生殖技術的迅速發(fā)展為解決這一難題提供了有效的途徑，但胚胎移植成功率仍限制在20%～30%。薄型子宮內膜已經成為體外受精-胚胎移植中周期取消和種植失敗的常見原因，直接導致子宮內膜容受性下降，影響臨床妊娠率［9］。目前，薄型子宮內膜的常規(guī)治療方式是聯(lián)合用藥，但藥物治療存在較多的不良反應，且患者的依從性較差［4］。本實驗通過建立薄型子宮內膜動物模型，從運動康復的角度初步探討機械加載對薄型子宮內膜的修復作用。

3.1 運動康復在女性生殖疾病中的運用 物理康復訓練是女性生殖系統(tǒng)疾病的重要治療手段。研究發(fā)現(xiàn)，運動訓練能改善排卵功能異常患者的卵巢功能，調節(jié)雌孕激素水平，改善子宮微環(huán)境，有助于子宮內膜生長［10］。此外，瑜伽運動能減少子宮血流血管的阻力，增加子宮血液灌注，改善子宮缺血的狀態(tài)，從而減輕痛經癥狀［11］。脈沖式機械加載作為一種模擬人體主動運動的新型物理康復治療方式，以一定頻率對滑膜關節(jié)進行機械刺激從而產生治療作用。研究表明，機械加載可以刺激血管生成，抑制炎癥反應，調節(jié)子宮內膜干細胞的分化功能［12-13］。與傳統(tǒng)的運動康復訓練相比，其能夠更好地幫助身體殘疾或制動的患者進行主動物理運動，達到治療的作用。

3.2 機械加載對薄型子宮內膜的療效 本研究采用95%乙醇宮腔內注射能較好地復制薄型子宮內膜模型。造模后大鼠子宮內膜損傷明顯，子宮內膜層萎縮變薄，內膜面積縮小，腺體數量減少，血管分布稀疏，間質部分水腫，宮腔失去原有完整結構，與之前Jang 等［14］研究結果基本一致。不同之處在于，本實驗采用許春燕等［6］的改良方法進行造模，將血管夾替換成壓強較小的0號絲線進行活結結扎子宮兩端，避免了對子宮的強烈刺激，減少實驗誤差，使其符合臨床相關癥狀。本研究結果顯示，施加機械加載干預后，能明顯增加薄型子宮內膜的厚度，增加內膜面積，恢復腔上皮和腺上皮細胞的正常結構，減輕間質水腫，促進內膜腺體和毛細血管的生成，提示機械加載能夠改善子宮內膜組織的病理損傷，緩解薄型子宮內膜的病程發(fā)展。

3.3 機械加載對血管生成和細胞增殖的作用 子宮內膜的血管生成和細胞增殖相互依賴、互相促進，是子宮內膜有效修復再生、為胚胎植入提供良好子宮內膜微環(huán)境的兩個關鍵性因素。VEGF 被認為是調控子宮內膜新生血管形成的重要因子，可增加子宮內膜血管通透性及血管化，通過調節(jié)子宮內膜微環(huán)境促進胚胎植入［15］。VEGF 與薄型子宮內膜關系密切，VEGF 低表達會抑制血管的生成，子宮內膜血供減少，影響子宮內膜的增殖和修復，從而導致子宮內膜容受性降低［3］。本研究結果顯示，與Sham組相比，TE組的VEGF陽性表達率明顯降低；經過機械加載治療后，TE+L組的VEGF陽性表達率明顯高于TE組，提示機械加載通過上調VEGF 的表達促進血管生成，增加子宮血液灌注，促進子宮內膜再生。Ki-67是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，被認為是細胞增殖的重要標志物，能夠客觀地反映出子宮內膜細胞增殖的程度［16］。本研究結果顯示，TE+L組Ki-67 陽性表達率明顯高于TE組，提示機械加載能通過上調Ki-67 的表達促進子宮內膜細胞增殖，修復損傷的子宮內膜組織。以上結果表明機械加載可能通過促進子宮內膜的血管生成和細胞增殖，從而修復薄型子宮內膜，但其具體機制尚有待于進一步研究。

3.4 不足與展望 既往治療薄型子宮內膜的藥物作用有限，效果不確切。因此，找到一種安全有效的治療方式是目前面臨的一大挑戰(zhàn)。本研究結果表明，機械加載對大鼠薄型子宮內膜有明顯修復作用，該作用可能與機械加載促進子宮內膜的細胞增殖和血管生成有關。這一研究為機械加載的物理康復治療和臨床應用提供了實驗依據。然而，機械加載治療薄型子宮內膜的具體作用機制仍需進一步研究。

Fig.3 Pictures showing unstained vaginal smear at different stages of estrous cycle in rats(×200)圖3 大鼠動情周期各階段的未染色陰道涂片（×200）

Fig.4 Pictures showing stained vaginal smear at different stages of estrous cycle in rats(HE staining，×200)圖4 大鼠動情周期各階段的染色陰道涂片（HE染色，×200）

Fig.6 The expression of VEGF in rat endometrium(immunohistochemistry staining，×400)圖6 大鼠子宮內膜VEGF的表達（免疫組化染色，×400）

Fig.7 The expression of Ki-67 in rat endometrium(immunohistochemistry staining，×400)圖7 大鼠子宮內膜Ki-67的表達（免疫組化染色，×400）