引黃灌區不同種植年限紫花苜蓿土壤養分與細菌群落特征研究

張文文，劉秉儒，牛宋芳

(寧夏大學西北土地退化與生態恢復國家重點實驗室培育基地, 寧夏大學西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室, 寧夏 銀川 750021)

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，直接或間接參與土壤碳氮養分循環、土壤結構的優化、植物生長調節等過程[1-4]，土壤細菌作為土壤微生物的主要成員，能夠快速高效地分解與轉化營養物質[5]，影響植物對養分的獲取和土壤肥力[6]，同時細菌群落結構的差異和變化規律也能反映土壤現狀及變化趨勢, 可用來指示土壤生態功能，因此土壤細菌群落和土壤養分關系的研究對引黃灌區紫花苜蓿(Medicagosativa)的生長具有重要指導意義。高通量測序技術能夠全面系統的分析土壤細菌的多樣性，深度測序的性能是高通量測序技術的優點所在[7]，也為本領域研究提供了極大的技術便利。

寧夏引黃灌區享引黃灌溉之利，水土光熱資源充足，農業發達，灌溉歷史悠久，是全國12個商品糧基地之一[8-9]。因日照充足，有灌溉條件，寧夏成為全國最適合種植苜蓿的區域，截止2015年，紫花苜蓿種植面積已達40多萬hm2，干草產量達18～22 t·hm-2，為寧夏畜牧業帶來極大經濟效益[10]。以往關于紫花苜蓿的研究主要集中在土壤養分變化，如楊恒山等[11-12]通過對不同種植年限紫花苜蓿土壤養分變化研究得到種植苜蓿對土壤理化性狀具有顯著影響，除pH外不同種植年限間差異明顯，任繼周[13]研究表明土壤有機質和全氮含量隨著種植年限的增加而升高，但其增長率隨種植年限的增加而降低。也有學者提出苜蓿地土壤養分增長年限受區域影響，如黃土高原區土壤有機質、全氮的變化表現為種植 5～10 年為增長期[14]，干旱區表現為種植4年養分含量最高[15]。引黃灌區苜蓿種植最佳年限的探討尚有缺乏，且大多學者研究主要集中于土壤養分和團粒結構，在土壤微生物與土壤養分之間的互作關系等方面研究尚不清楚。鑒于此，本研究采用16S rRNA擴增子測序技術研究了寧夏引黃灌區不同種植年限(1～6年)紫花苜蓿土壤細菌群落和土壤養分分布特征，旨在從微生物和養分等角度探討紫花苜蓿的最佳種植年限，為西北地區紫花苜蓿種植及持續高產提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 研究區概況及樣品采集

研究區位于寧夏回族自治區銀川市(N 38°30′，E 106°06′)西夏區賀蘭山人工紫花苜蓿農場。研究區海拔為1135 m，屬于溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫為8.4 ℃，最高氣溫為38 ℃，最低氣溫為-20 ℃，年平均降水量約為200 mm，年蒸發量約為2250 mm，年平均日照時數為3075.5 h，無霜期為160 d，土壤類型為淡灰鈣土，地下水位約4～5 m[16]。

本研究分別以種植時間為1～6年(2012-2017年)的紫花苜蓿地為6個處理，每個處理設置3個面積30 m×30 m的小樣方作為3個重復，每個小樣方按照S型布點，清除掉地上凋落物和其他多余物質，用直徑4 cm、高20 cm土鉆，采用5點混合法取0～20 cm土壤樣品，每個重復均取3個平行樣，6個處理共采集土樣54個。每個土樣采集2份，1份將鮮樣裝入經高溫滅菌的凍存管并立即放入-196 ℃的液氮帶回室內測定，另1份裝入自封袋帶回實驗室自然風干，并按照實驗后期要求過篩用于土壤各項理化指標測定。

1.2 測定方法

土壤理化指標測定：采用水土比2.5∶1.0懸液測定土壤pH；采用水土比5∶1浸提液測定土壤電導率；采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定土壤有機碳；采用凱式定氮法測定全氮；采用堿解擴散法測定堿解氮；采用NaOH堿溶-鉬銻抗比色法測定全磷；采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定速效磷[17]。

細菌總DNA的提取：土壤碾碎過0.18 mm篩后，首先采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide)或十二烷基苯磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate)方法對樣本的基因組DNA進行提取，用Qubit 2.0檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性[18]。每個樣品3個重復，將同一樣品的土壤DNA混合，作為每份土壤樣品的總DNA。取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1，以稀釋后的基因組DNA為模板，采用16S rRNA基因中的V4高變區引物515 F和806 R鑒定細菌多樣性，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR擴增，確保擴增效率和準確性，根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，之后通過HiSeq 2500 PE 250進行上機測序。下機數據采用prinseq去除低質量的數據(reads)，然后根據下機得到的數據之間的overlap關系將成對的reads拼接成一條序列，為得到高質量的reads，去除tags兩端的barcode引物序列，去除嵌合體及其短序列等后得到clean tags[19-20]。拼接過濾后的clean tags與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列[21]，得到最終的有效序列(effective tags)。

1.3 數據分析

利用Uparse軟件對序列進行聚類，相似性定為0.97，操作分類單元被認為可能接近于屬。用Qiime軟件(Version 1.9.1)中的blast方法與Unit數據庫進行物種分類、細菌豐度及多樣性指數的計算、環境因子(土壤理化數據)關聯分析和主成分分析(principle component analysis,PCA)，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制PCA和環境因子分析熱圖。采用SPSS 19.0對土壤理化數據進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同種植年限苜蓿地土壤養分變化

由表1可知，研究區pH為 8.5～8.7，屬于堿性土壤。多重比較結果顯示，隨著種植年限的增加，土壤電導率、全磷和速效磷含量均無顯著變化；土壤、有機碳、全氮和堿解氮含量均表現為先降低后增高的趨勢，且在第5年達到最大，說明苜蓿地土壤養分隨著種植年限的增加可能會出現一個周期性的變化規律。

2.2 不同種植年限苜蓿地土壤OTU水平分析

對操作分類單位(operational taxonomic units，OTU)聚類和注釋結果顯示， 6個樣本得到的總tag數為518456，其中用于構建OTUs并且獲得注釋信息的tags數為483980，占總數的95%；unclassified tags和頻數為1的unique tags是無法被聚類到OTUs的tags數目，共計24477，各樣本統計結果如表2所示。采用隨機抽樣方法抽取數據，隨機抽取它們所代表物種數目(即OTUs數目)，以抽取的測序數據量與對應的物種數來構建稀釋曲線。6個樣本的稀釋曲線如圖1所示，不同種植年限苜蓿地土壤細菌豐富程度表現為1 yr>5 yr>4 yr>3 yr>6 yr>2 yr。

表1 不同種植年限紫花苜蓿土壤理化性狀Table 1 Soil physical and chemical properties of alfalfa with different cultivation years (mean±SD, n=3)

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column represent significant difference at theP<0.05 level.

表2 不同種植年限苜蓿地土壤OTU聚類和注釋情況統計Table 2 Statistics of soil OTU clustering and annotation in alfalfa fields with different cultivation years

2.3 不同種植年限苜蓿地土壤細菌組成分析

圖1 細菌稀釋曲線分析Fig.1 Analysis of bacterial dilution curve

2.3.1各樣地細菌群落在門水平上的組成和相對豐度 6個不同種植年限苜蓿地土壤樣品中細菌群落相對豐度前十的細菌門分別為：變形菌門(Proteobacteria) (44%)、酸桿菌門(Acidobacteria) (13%)、擬桿菌門(Bacteroidetes) (11%)、厚壁菌門 (Firmicutes) (4%)、放線菌門(Actinobacteria) (5%)、單胞菌門(Gemmatimonadetes) (6%)、疣微菌門(Verrucomicrobia) (3%)、浮霉菌門(Planctomycetes) (3%)、綠彎菌門(Chloroflexi) (2%)和奇古菌門(Thaumarchaeota) (0.2%)，共占細菌總數的91.2%。其中變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門占細菌總數的68%，說明這3個門的細菌為苜蓿地土壤樣本中較具優勢的菌群。除厚壁菌門在6年中有大幅度的波動變化外(相差10倍左右)，其余菌門變化幅度都較小，1～6年總體變化呈先升高后降低的變化趨勢，這與之前土壤有機質、全氮和堿解氮變化趨勢正好相反(圖2)。

2.3.2各樣地細菌群落在目水平上的組成和相對豐度 目水平上細菌群落相對豐度前十的分析結果表明，相對豐度占比由高到低分別為unidentified_Gammaproteobacteria (18%)、殼聚糖目(Chitinophagales) (7%)、 unidentified_Acidobacteria (6%)、梭菌目(Clostridiales) (3%)、粘球菌目(Myxococcales) (5%)、單胞菌目(Gemmatimonadales) (4%)、噬纖維菌目(Cytophagales) (4%)、假單胞菌(Rhizobiales) (3%)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales) (3%)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales) (3%)，共占細菌總數56%。Unidentified_Gammaproteobacteria為目水平上優勢菌，占了豐度前十菌群數的27%，其余各菌所占比例較為均勻(圖3)。

2.4 不同種植年限苜蓿地土壤細菌群落多樣性分析

2.4.1多樣性指數分析 不同種植年限苜蓿地土壤細菌多樣性指數分析結果表明，Shannon多樣性指數、Chao1指數和ACE指數在種植1年苜蓿地最大，分別為10.06、5157.33和5261.06，其中Shannon多樣性指數與其他各年限之間均無顯著性差異，Chao1指數與ACE指數表現為1 yr與2和6 yr間均存在顯著性差異，從大到小依次為1 yr>5 yr>4 yr>3 yr>2 yr>6 yr (表3)。

2.5 土壤環境因子與土壤細菌群落組成相關性分析

對土壤環境因子與土壤細菌門水平下豐度進行 Spearman相關性分析，結果表明堿解氮、全氮和有機碳與一部分細菌門類存在顯著和極顯著相關性。有機碳與Candidatus_Magasanikbacteria、Candidatus_Yanofskybacteria具有極顯著負相關關系，與Hydrogenedentes、Candidatus_Peregrinibacteria、Melainabacteria具有顯著負相關關系；堿解氮與Candidatus_Peregrinibacteria具有極顯著負相關關系，與Candidatus_Yanofskybacteria、Parcubacteria具有顯著負相關關系；全氮與螺旋原蟲門(Spirochaetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、無壁細菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)具有顯著正相關關系，與浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)具有顯著負相關關系。全磷、電導率和pH與個別細菌門類存在顯著相關性(圖4)。

圖2 不同種植年限苜蓿地土壤細菌群落相對豐度前十的細菌門Fig.2 The first ten phylum of soil bacterial community in alfalfa field with different cultivation years

圖3 不同種植年限苜蓿地土壤細菌群落相對豐度前十的細菌目Fig.3 The first ten order of soil bacterial community in alfalfa field with different cultivation years

指數 Index1 yr2 yr3 yr4 yr5 yr6 yrShannon10.06±0.12a9.80±0.17a9.90±0.23a10.01±0.04a9.96±0.04a9.81±0.24aChao15157.33±310.31a4467.96±230.03b4703.16±329.02ab4806.30±196.09ab5087.91±150.72a4395.99±457.96bACE5261.06±312.91a4538.10±255.48b4792.38±372.63ab4885.52±194.63ab5168.96±136.93a4466.54±457.52b

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same line indicate significant difference (P<0.05).

2.6 土壤細菌群落間的主成分分析

主成分分析是一種對多維數據進行降維，從而提取出數據中最主要的元素和結構的方法。應用PCA分析能夠提取出最大程度反映樣本間差異的兩個坐標軸，從而將多維數據的差異反映在二維坐標圖上。樣本在圖中的距離越接近，則它們的群落組成越相似。基于OTU水平的PCA分析結果表明，PC1和PC2的貢獻率分別為10.63%和9.32%。1和5 yr距離較近，2和6 yr距離較近，3和4 yr距離較近，即這3組間細菌群落組成相似性較高(圖5)。

圖4 土壤環境因子與細菌門水平相關性Fig.4 Correlation between soil environmental factors and bacterial level*表示顯著相關(P<0.05)，**表示及顯著相關(P<0.01)。* represents significant correlation at P<0.05 level, and ** represents significant correlation at P<0.01 level.

3 討論

圖5 細菌群落間的主成分分析Fig.5 PCA analysis among bacterial communities

通過對6個樣本門水平下細菌群落組成和相對豐度分析發現，苜蓿地土壤中主要有9類細菌，分別是變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、芽單胞菌門、疣微菌門、浮霉菌門、綠彎菌門。其中郭麗麗等[22]研究發現疣微菌門的消失是油用鳳丹牡丹連作障礙形成的重要原因，而苜蓿地土壤中疣微菌門占細菌總數的3%，且隨著種植年限的增加變化較為穩定，這可能是苜蓿未出現連作障礙的主要原因。羅明等[23]研究發現芽單胞菌門在黃河三角洲地區含量較高，為4.74%～5.69%，本研究中芽單胞菌門細菌豐度占比高達6%，但本研究區位于干旱區，其占比高可能是因為引用黃河水灌溉的結果。另外變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是許多土壤細菌的3大優勢門類[24-25]，且在本研究中發現這3大優勢門類隨種植年限變化呈現出較為穩定的變化趨勢。

土壤中數量眾多的微生物既是土壤形成過程的產物，也是土壤形成的推動者[26]，因此它參與完成土壤中各種復雜的生化反應過程[27]。Alpha多樣性可分析樣品內菌種類別的豐富度和菌種數目的均勻度，Alpha多樣性越高，細菌種類越豐富，群落越穩定[22]。本研究結果表明，Shannon指數并無顯著性變化，說明樣地土壤細菌群落均勻度較高，這與細菌群落結構組成具有相同特征，可能的原因是樣地為人工草場，具有相同的田間管理模式，因此細菌群落具有較好的均勻性。本研究Chao1指數和ACE指數以及物種豐度(稀釋曲線)隨著種植年限的遞增出現先減小后增大的變化率，即說明連作會導致細菌豐富度和多樣性下降，這與韓亞飛等[28]研究所得結果一致，并且在降低到一定程度又會有所回升，在第5年時達到最大值，南麗麗等[29]的研究結果支持這一結論。導致細菌群落豐富度和多樣性回升的可能原因是隨著種植時間的增加，土壤表面凋落物累積增多，從而導致土壤養分的回升，進而導致細菌群落豐富度和多樣性增大。對各樣本細菌群落間進行主成分分析表明，土壤細菌群落多樣性變化可能存在一個周期性規律，但由于研究時間只有6年，對周期持續時間研究缺乏數據支持，因此具體周期變化需要后續工作進一步驗證。

大量研究表明，土壤細菌多樣性與土壤理化性質密切相關[30-31]。本研究將土壤理化指標與門水平下細菌組成進行Spearman相關性分析得到，有機碳與5類細菌呈顯著負相關關系，與其中兩類呈極顯著負相關關系，Liu等[32]發現中國東北黑土的細菌多樣性和有機碳呈負相關關系，Sul等[33]研究發現，有機碳含量低可能是導致微生物多樣性低的原因。硝化螺旋菌門參與土壤硝化[34]，本研究發現硝化螺旋菌門與土壤全氮具有顯著相關性。同時，紫花苜蓿共生固氮菌及其固氮能力的研究是土壤微生物學中的一個重要組成部分。在種植第二年的時候土壤堿解氮含量降到最低，可能原因是在生長前期，紫花苜蓿需從土壤中吸收大量的氮素[35]。隨著種植年限的增加土壤氮素含量又呈現緩慢上升趨勢，這與豆科植物的固氮作用有很大關系，因此看來在一定閾值內，紫花苜蓿種植年限越長對土壤的改良效果越好；全氮、堿解氮也有不同程度增加，這與有關研究結論一致[36-37]。綜合來看，土壤理化性質與土壤細菌之間確實存在一種互相反饋機制，且種植年限為5年時紫花苜蓿土壤養分和微生物環境同時達到最佳水平，但這種現象會呈周期性循環還是5年以后會持續下降需要進一步研究。

4 結論

變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和放線菌門是不同種植年限苜蓿地土壤優勢菌群，酸桿菌門與土壤全氮具有極顯著正相關關系，放線菌門與土壤全氮具有顯著正相關關系；Shannon指數隨著種植年限增加無顯著性變化，種植時間為1～6年的紫花苜蓿地土壤細菌多樣性組成相似性高，且群落優勢菌群不受種植時間的影響；土壤養分和土壤細菌群落組成及豐度都在種植5年時達到最大，土壤有機碳、堿解氮、全氮是影響細菌群落組成的主要環境因子。