黃芪三萜皂苷對心肌重構細胞模型的保護作用

壽鴻飛 劉晶 劉天龍 張銘杰 劉小雷

1烏蘭察布市中心醫院藥劑部（內蒙古烏蘭察布012000）；2內蒙古醫科大學附屬醫院藥劑部（呼和浩特010030）；3內蒙古醫科大學藥理學教研室（呼和浩特010110）

心肌重構是心臟在多種病理刺激下出現的結構和功能改變，以心室容積增加、心肌纖維化及心臟舒張和收縮功能障礙作為主要的臨床癥狀［1］。心肌重構是最常見的高血壓靶器官損害，其作為獨立危險因素伴隨在進行性心衰和梗死性心律失常的整個病理變化中［2］。目前，雖然多種基因、蛋白及非編碼RNA 被報道與心肌重構的發生相關，但心肌重構的發病機制尚不明確，臨床上仍以控制血壓為主要的治療手段［3-5］。雖然降壓治療能夠顯著地降低高血壓患者發生心肌重構的風險，但很多高血壓患者在較好控制血壓的條件下仍會出現心肌重構表型，說明控制血壓對心肌重構的防治效果并不理想［6］。因此，系統地研究心肌重構的干預手段對于有效地預防和治療高血壓心衰具有重要的意義。

黃芪是蒙古黃芪干燥的根，具有止汗、滋補和利尿等功效，為內蒙古自治區的道地藥材［7］。目前，臨床上有近百種與黃芪有關的中、蒙藥方劑和中成藥廣泛地用于心血管疾病的預防和治療，如芪冬頤心口服液、芪參膠囊及當歸黃芪湯等［8-9］。黃芪三萜皂苷（Astragalus triterpenoid，AST）是黃芪的重要活性成分，其具有抗炎、抗凋亡、抗氧化應激及保護內皮功能等作用，但關于AST 對心肌重構的保護作用及機制目前還鮮有關注［10-11］。文獻報道顯示，炎癥反應、心肌細胞凋亡、氧化應激及內皮功能障礙與心肌重構的發生有著密切的關系，因此，筆者推測AST 可能對心肌重構具有保護作用［12］。本研究以AST 為研究對象，在體外系統地研究其對心肌重構的保護作用及機制，這對于尋找心肌重構新的干預靶點和治療手段具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及藥物乳小鼠的原代心肌細胞和心肌成纖維細胞由本課題組分離和培養；重組人血管緊張素II（A9525）購于Sigma 公司；AST（781-200311，純度＞98%）購于中國生物制品鑒定所。

1.2 心肌細胞和心肌成纖維細胞的分離及培養依據文獻報道的方法分離和培養原代心肌細胞和心肌成纖維細胞，在細胞水平研究AST 對AngII誘導心肌細胞肥大和心肌成纖維活化的保護作用［13］。簡言之，使用0.062 5%的胰酶在37 ℃不斷攪拌下對心肌組織進行逐次消化，每次消化5 min，每次消化完成后將含有細胞的消化液加入到10%FBS 的DMEM/高糖培養基中以終止胰酶活性。消化完成后，合并收集的細胞懸液，1 000 ×g 離心5 min。使用含10%FBS 的DMEM/高糖培養基重懸細胞并將細胞接種于10 cm 皿中，在37 ℃，2.5%CO2的條件下進行差速貼壁2 h。差速貼壁完成后，貼壁的心肌成纖維細胞繼續使用含10%FBS 的DMEM/高糖培養基進行培養，48 h 后傳代得到心肌成纖維細胞。未貼壁的心肌細胞直接以5 ×103個/孔和1 × 105個/孔的濃度分別接種于12 孔板和6 孔板中，48 h 后更換培養基并觀察心肌細胞搏動情況。

1.3 心肌重構細胞模型的建立及AST 干預本部分實驗共設3 個實驗組，即Blank 對照組，AngII 誘導組及AST 干預組。將心肌細胞和心肌成纖維細胞培養48 h 后，更換FBS-free DMEM/高糖培養基饑餓細胞24 h以進行同步化。同步化后，Blank組細胞更換新的FBS-free DMEM/高糖培養基繼續培養，AngII 組細胞使用含有10-6mol/L AngII 的FBSfree DMEM/高糖培養基誘導心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞活化，AST 干預組細胞先使用含有100 μmol/LAST 的FBS-free DMEM/高糖培養基預處理細胞90 min，預處理結束后，更換含有10-6mol/L AngII 和100 μmol/L AST 的FBS-free DMEM/高糖培養基。12 孔板細胞培養24 h 后提取RNA 以檢測相關因子的表達水平，6 孔板細胞培養48 h 后提取蛋白以檢測Wnt 信號通路關鍵蛋白β-Catenin 的表達水平。

1.4 心肌細胞鬼筆環肽染色培養心原代肌細胞48 h 后，按1.3 描述的方法使用AngII 誘導心肌細胞肥大并使用AST 進行干預。AST 干預48 h 后，棄去培養基并使用37 ℃預熱的PBS 清洗貼壁細胞2 次。每孔加入3.7%的多聚甲醛200 μL 室溫固定心肌細胞10 min，固定完成后使用PBS 洗滌心肌細胞2 次。棄掉培養板中的PBS，每孔加入200 μL 熒光標記的鬼筆環肽染色劑，室溫避光反應20 min。染色完成后，DAPI 封片并在熒光顯微鏡下觀察和拍照，使用Image J 軟件檢測心肌細胞表面積。

1.5 Real-time PCR檢測相關因子的表達水平設計和合成用于檢測心肌細胞和心肌成纖維細胞中α-SMA、Col1α1、Col3α1、ANP、BNP、TGF-β、Wnt-1、Wnt-3α、fz2、Dvl1、Dvl2 表達水平的上、下游引物，利用Real-time PCR 檢測上述因子的表達水平。以GAPDH 作為內參，采用Quante Studio Soft 1.3 軟件通過2-△△Ct法進行相對定量分析。

1.6 Western Blot 檢測使用Western Blot 檢測心肌細胞中Wnt 信號關鍵蛋白β-Catenin 及成纖維細胞中α-SMA、Col1α1 及Col3α1 的表達水平。Western Blot實驗操作依據文獻記錄的方法進行［14］。使用10%的分離膠和濃縮膠對蛋白進行電泳，電泳完成后進行轉膜，轉膜條件為300 mA，80 min。轉膜完成后，切下含有目的條帶NC 膜，使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。封閉完成后，將抗體加入到含有相應目的條帶的孵育盒中，4 ℃孵育過夜，抗體的稀釋倍數為1 000，抗體稀釋液為TBST。一抗孵育完成后，TBST 清洗NC 膜3 次，每次5 min。加入HRP 標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h后進行顯色。

1.7 統計學方法采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料采用± s 表示，統計方法采用單因素方差分析，組間比較采用SNK 法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AST 對AngII 誘導的心肌細胞肥大具有顯著的保護作用10-6mol/L AngII 誘導心肌細胞24 h后，AngII 誘導組細胞ANP 和BNP 的表達水平分別是正常心肌細胞的2.4 倍和3.1 倍，而兩者在AST干預組心肌細胞中的表達水平分別是正常心肌細胞的1.23 倍和1.36 倍，組間比較具有顯著差異（P ＜0.05，圖1A）。心肌細胞鬼筆環肽染色結果顯示，AngII 誘導組心肌細胞的表面積是正常心肌細胞的2.5倍，而AST 干預組心肌細胞的表面積是正常心肌細胞的1.13 倍，組間比較具有顯著性差異（P ＜0.05，圖1B）。上述結果說明，AST 對AngII 誘導的心肌細胞肥大具有顯著的保護作用。

圖1 AST 對AngII 誘導的心肌細胞肥大的保護作用Fig.1 Protective effect of AST on AngII-induced cardiomyocyte hypertrophy

2.2 AST 對AngII 誘導的心肌成纖維細胞活化具有顯著的保護作用qPCR 檢測結果顯示，AngII誘導心肌成纖維細胞24 h 后，α-SMA、Col1α1 和Col3α1 在心肌成纖維細胞中的表達水平顯著增加，其相對表達量分別是正常心肌成纖維細胞的3.25 倍、2.17 倍及2.2 倍，而AST 干預組心肌細胞中三者的相對表達水平分別是正常心肌細胞的1.31 倍、1.23 倍及1.05 倍，組間比較差異具有統計學意義（P ＜0.05，圖2A），相似的結果也被Western Blot 檢測所證實（P ＜0.05，圖2B）。上述結果說明，AST 對AngII 誘導的成纖維細胞表型轉化和活化具有顯著的抑制作用。

圖2 AST 對AngII 誘導的心肌成纖維細胞活化的保護作用Fig.2 Protective effect of AST on AngII-induced fibroblast activation

2.3 AST 對AngII 誘導的Wnt 信號在心肌細胞中的活化和TGF-β在心肌成纖維細胞的表達具有顯著地抑制作用qPCR 結果顯示，AngII 誘導心肌細胞和心肌成纖維細胞24 h 后，Wnt-1、Wnt-3α、fz2、Dvl1 和Dvl2 在心肌細胞及TGF-β在心肌成纖維細胞中的表達水平顯著增加，而AST 對此有顯著地抑制作用（P ＜0.05，圖3A、B）。Western blot 結果顯示，AST 對AngII 誘導的β-Catenin 在心肌細胞中的表達具有顯著的抑制作用（P ＜0.05，圖3B、C）。上述結果說明，AST 對AngII 誘導的心肌細胞肥大的保護作用與其抑制Wnt 信號活化有關，而AST 對AngII 誘導的成纖維細胞活化的保護作用與其抑制TGF-β表達有關。

圖3 AST 對Wnt 信號通路相關蛋白在心肌細胞中的表達和TGF-β 在心肌成纖維細胞中的表達具有顯著地抑制作用Fig.3 inhibitive effect of AST on expression level of Wnt related protein in cardiomyocyte and TGF-β in Fibroblasts

3 討論

本研究初步在體外驗證了AST 對AngII 誘導心肌重構的保護作用，結果顯示，AST 對AngII 誘導的心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞的活化具有顯著的抑制作用，這與其抑制AngII 誘導的Wnt 信號在心肌細胞中的活化和TGF-β在心肌成纖維細胞中的表達有關。

A 型心房鈉尿肽（ANP）和B 型尿鈉肽（BNP）是一種由心房合成、貯存和分泌的活性多肽，具有強大的利鈉、舒張血管、降低血壓和對抗腎素-血管緊張素系統和抗利尿激素作用。當心臟壓力負荷和容量負荷增加時，心房會反射性的合成和分泌ANP 和BNP 以減輕前、后負荷和改善心功能。因此，ANP 和BNP 常作為判斷心功能是否受損的標志物在很多心肌重構相關的研究中被檢測［15］。本研究發現，在10-6mol/L AngII 刺激心肌細胞24 h后，ANP 和BNP 的表達水平顯著增加，而AST 對此有顯著的抑制作用，說明AST 對AngII 誘導的心肌細胞損傷具有保護作用。此外，在長期的機械壓力和其它病理因素刺激下，心臟成纖維細胞逐漸轉化為肌成纖維細胞，轉化后，其增殖活性、α-SMA 和膠原合成能力顯著增加，大量的膠原堆積在細胞外基質（ECM）而影響心臟的正常結構和功能。因此，本研究檢測的成纖維細胞α-SMA、col1α1 和col3α1 表達水平常作為病理條件下成纖維細胞活化的標志物，而AST 對AngII 誘導的成纖維細胞的活化具有顯著的抑制作用［16］。

Wnt 信號在心肌發育和病理性心肌重構的發生過程中扮演重要的角色，特別是經典的Wnt/GSK-3β/β-Catenin 通路已被證實參與多種病因誘導的心肌重構［17］。Wnt 是一種分泌型脂質修飾的糖蛋白，其能夠與細胞表面受體Frz receptor 結合，通過經典的Wnt 途徑和非經典的Wnt 途徑調節心肌細胞的發育和肥大反應。β-Catenin 是細胞中重要的鈣離子依賴型第二信使，胞質中的β-Catenin常與其它蛋白相互作用形成復合物及被磷酸化失去穩定性而被降解［18］。當Wnt 分泌增加時，其與細胞表面受體相互作用后將活化GSK-3β，活化的GSK-3β將抑制β-Catenin 復合物的形成和磷酸化而穩定β-Catenin，非磷酸化的β-Catenin 進入細胞核作為重要的轉錄調節因子促進多種與心肌重構有關的基因表達［19］。在本研究中，AngII 誘導心肌細胞24 h 后，Wnt 信號相關蛋白Wnt-1、Wnt-3α、fz2、Dvl1 和Dvl2 表達水平顯著增加，而AST 對此有顯著的抑制作用，說明AST 對AngII 誘導的心肌細胞Wnt 信號的活化具有顯著的抑制作用。

TGF-β信號通路在AngII 和壓力誘導的病理性心肌纖維化中扮演重要的角色。研究顯示，TGF-β能夠通過Wnt/β-catenin 信號通路促進心肌的纖維化和與纖維化相關基因的表達［20-21］。體外研究顯示，TGF-β能夠通過抑制MMP 的表達及促進MMP抑制基因的表達直接誘導細胞外基質的沉積［22］。β-Catenin 作為是TGF-β信號的重要下游因子，其能夠有效地調節膠原和其他ECM 的表達［21］。本研究發現，AST 對AngII 誘導的TGF-β在心肌成纖維細胞中的表達具有顯著的抑制作用，這可能是其保護心肌纖維化的重要機制。

本研究發現，AST 在體外對AngII 誘導的心肌重構具有顯著的保護作用，但體外研究與體內研究尚存在很大的差異。因此，下一步將在動物水平驗證AST 對心肌重構的保護作用并通過心肌組織轉錄組測序尋找AST 保護心肌重構的干預靶點。