Caspase-3 基因過表達抑制LN-18 人神經膠質瘤細胞移植瘤生長

葛風 蔣云召 王泳

無錫市第三人民醫院神經外科（江蘇無錫214000）

神經膠質瘤是目前臨床上最常見腦腫瘤，約占所有顱內原發腫瘤的一半，每年新增約14 萬病例，65 歲以上人群發病率明顯增高［1］。由于晚期腫瘤浸潤性生長，與腦組織間無明顯邊界，難以做到全部切除，一般都主張綜合治療，患者5年生存期不足20%［2］。針對神經膠質瘤發病率高、復發率高和病死率高的特點，有必要探索新的治療手段，以延長其生存期和改善患者生存質量。細胞凋亡與神經膠質瘤進展密切相關，如何誘導神經膠質瘤細胞凋亡已成為近年來研究熱點。caspase-3 蛋白是促細胞凋亡關鍵酶，通過調節凋亡信號通路傳導，促進細胞凋亡［3］。本研究構建caspase-3 基因過表達慢病毒載體，并轉染LN-18 人神經膠質瘤細胞，觀察caspase-3 蛋白過表達對LN-18 人神經膠質瘤細胞移植瘤生長作用的影響，為caspase-3 蛋白在神經膠質瘤治療應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人LN-18 人神經膠質瘤細胞購自上海榕柏生物技術有限公司；胎牛血清、細胞培養基、青霉素-鏈霉素、細胞培養耗材和胰蛋白酶均購自美國賽默飛生命科技公司；FITC 標記的TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海生物工程有限公司；鼠抗人單克隆caspase-3 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗鼠IgG 均購自美國Abcom 公司；兔抗鼠β-actin 單克隆抗體購自美國sigma 公司。蛋白電泳儀為美國Bio-Rad 公司產品。上海吉瑪基因公司提供caspase-3 基因相關產品和慢病毒載體。

1.2 構建caspase-3 轉染慢病毒在線搜索caspase-3 基因信息，設計模板序列基因，上游引物序列：5′-CCCGAATAAGAGAGAACCAAC-3′，下游序列：5′-CATTCCTTATATGTCTCCGTAC-3′，PCR 反應條件：預變性（94 ℃）2 min；變性（94 ℃）45 s，退火（55 ℃）25 s，延伸（72 ℃）35 s，共35 次循環，延伸（72 ℃）6 min，抽提GV128 質粒，利用自失活型慢病毒包裝系統，將包裝質粒pHelper1.0、pHelper2.0和caspase-3 基因載體質粒共轉染239T 細胞，轉染48 h 后，1 000 r/min 高速離心，收集含caspase-3 基因慢病毒顆粒細胞上清液，-80 ℃保存備用。

1.3 體外轉染LN-18人神經膠質瘤細胞待細胞融合至90%，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min 離心收集細胞，細胞重懸后以1 × 105個/mL 接種48 孔板。LN-18 人神經膠質瘤細胞最佳轉染復數為150，設置3 組，其中添加5 μg/mL Polybrene 和50 μL caspase-3 基因重組病毒上清液為轉染組，添加5 μg/mL Polybrene + 50 μL 陰性對照病毒上清液為對照組和不添加病毒上清液為空白組，37 ℃孵育10 h，更換細胞培養液，繼續孵育。

1.4 免疫印跡法檢測caspase-3 蛋白表達蛋白裂解液收集蛋白，檢測樣品總蛋白濃度（BCA 法），高溫致蛋白變性，80 V SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉膜2 h，5%牛血清蛋白封閉1 h，切割薄膜，加入1∶300 鼠抗人單克隆caspase-3 抗體，4 ℃孵育過夜，加入1∶1 000 HRP 標記羊抗鼠二抗室溫孵育30 min，1∶1 000稀釋β-Actin 作為內參，顯色定影，軟件分析雜交條帶。

1.5 構建LN-18 人神經膠質瘤移植瘤裸鼠模型待LN-18 細胞生長至對數期，胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞，1640 培養基重懸細胞（密度1×108個/mL），將上述細胞懸液注射至裸鼠背部皮下，200 μL/只，細胞數量約2 × 107個，共設轉染組、對照組和空白組，每組5 只裸鼠，每3 天記錄腫瘤大小情況，比較各分組瘤塊體積，瘤塊測量用長徑（a）×短徑（b）表示，單位cm，腫瘤體積=0.5×a×b2，接種21 d 后處死實驗動物，取出瘤塊，測量對比各組腫瘤體積。

1.6 腫瘤組織內細胞凋亡測定取出各分組腫瘤組織，甲醛固定，石蠟包埋，切片機制備5 μm 蠟塊切片，梯度酒精法脫蠟入水，置于0.2%曲拉通溶液破膜10 min，PBS 緩沖液清洗3 遍，加入25 μL TUNEL 細胞凋亡檢測液，25 ℃避光孵育60 min，PBS 緩沖液清洗3 遍，熒光顯微鏡下觀察并拍照，利用IPP 軟件測定各組熒光積分光密度（integral optical density，IOD），以空白組為對照計算相對IOD 值。

1.7 統計學方法以（± s）表示實驗結果，采用單因素多樣本方差分析比較多組間均值，采用t 檢驗比較兩組間均值差異，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染效率測定慢病毒載體可攜帶多種熒光標記，體外轉染LN-18 人神經膠質瘤細胞72 h，流式細胞儀上樣檢測細胞轉染率達到83.7%（圖1 A），倒置顯微鏡下觀察轉染LN-18 人神經膠質瘤細胞（圖1B），熒光顯微鏡下觀察到滿視野綠色熒光分布（圖1C），證實其具備后續實驗應用的可行性。

2.2 caspase-3蛋白表達轉染組、對照組和空白組caspase-3 蛋白相對表達量分別為（1.259 ± 0.238）、（0.181±0.079）和（0.147±0.069），轉染組caspase-3蛋白水平顯著增加（P ＜0.001），對照組與空白組差異無統計學意義（P ＞0.05，圖2）。

圖1 體外慢病毒轉染LN-18 人神經膠質瘤細胞Fig.1 LN-18 human glioma cells were transfected by lentivirus in vitro

圖2 各組Caspase-3 蛋白表達Fig.2 The expression of Caspase-3 protein in each group

2.3 腫瘤生長曲線測定每隔3 d 測量各組腫瘤生長體積，對比各分組腫瘤體積隨時間變化情況，至皮下移植21 d，轉染組、對照組和空白組瘤塊體積分別為（0.52 ± 0.17）、（2.61 ± 0.22）和（2.38 ±0.19）cm3，（F=104.241，P=0.021 89），表明腫瘤生長受到明顯抑制（圖3）。

2.4 細胞凋亡分析本研究采用FITC 標記凋亡信號，當綠色信號越高時，表明細胞凋亡越明顯。移植皮下成瘤21 d 后，轉染組、對照組和空白組熒光強度分別為（6 572±1 319）、（908±199）和（875 ± 262），轉染組細胞凋亡數目顯著高于空白組和對照組，差異具有統計學意義（圖4，P ＜0.001）。

圖3 腫瘤生長體積測定Fig.3 Tumor growth volume determination

圖4 細胞凋亡率測定（×100）Fig.4 The measurement of cell apoptosis

3 討論

細胞凋亡是細胞自主程序性死亡，其中涉及多種基因的激活、表達以及調控，在腫瘤發生發展過程中起著重要作用［4］。細胞凋亡與腫瘤細胞分化程度、腫瘤組織學分級、淋巴轉移程度和腫瘤臨床分期均存在顯著相關性［5］。誘導腫瘤細胞凋亡被認為是治療癌癥的創新思路。細胞凋亡均伴隨著caspase 基因激活和異常表達，caspase-3 蛋白是細胞凋亡信號傳導關鍵環節，活性caspase-3 可降解相應的胞漿胞核底物，誘導細胞凋亡，當caspase-3 活性受到抑制，則出現細胞凋亡異常，從而誘發腫瘤［6］。caspase-3 蛋白在神經膠質瘤組織中高表達，陽性率達到78.85%（41/52），而正常組織caspase-3 蛋白陽性率僅15.38%（2/13）［7］。同時，藥物誘導的神經膠質瘤細胞凋亡常常伴隨著caspase-3基因激活和caspase-3 蛋白高表達，暗示其為誘導神經膠質瘤細胞死亡過程中的一項重要環節［8］。另外，神經膠質瘤腫瘤分期越高，caspase-3 蛋白陽性表達率越低，這提示caspase-3 蛋白表達水平與神經膠質瘤惡性程度及患者預后呈負相關［9］。基于以上事實，擬利用基因工程技術促caspase-3 蛋白過表達，則有望治療神經膠質瘤。

慢病毒屬是反轉錄病毒科下的一種分支，可產生更加穩定的體外轉染效果，通過細胞表面受體和慢病毒膜糖蛋白相互作用進入宿主細胞，可使其持續表達目的蛋白［10］。脂質體和質粒是目前實驗室常用轉染劑，其操作方法簡單，但兩者細胞轉染率均較低，生物安全性不高，且存在較明顯細胞毒性［11-12］。與之相比，慢病毒轉染效率明顯升高，且與轉染靶細胞類型密切相關，通常可達50%～80%［13］。筆者利用慢病毒轉染LN-18 人神經膠質瘤細胞，體外轉染實驗中，利用流式細胞儀檢測GV128 慢病毒載體轉染效率高達83.7%，筆者推測這種高轉染效率與本研究選用的LN-18 細胞類型密切相關，LN-18 膠質瘤細胞活性強，其慢病毒轉染率隨之升高。觀察caspase-3 基因過表達對于移植瘤生長的影響是本研究的重點和難點。既往有學者采用慢病毒瘤體注射方式，但這種方式存在試劑浪費，注射不均勻，體內轉染效率低且無法準確檢測等諸多缺陷［14-15］。本研究在體外預先利用caspase-3 基因過表達慢病毒轉染LN-18 人神經膠質瘤細胞，隨后再皮下注射移植成瘤，則可避免慢病毒瘤體注射缺陷，使實驗過程變得更為清晰和可控。體內結果證實，轉染組細胞凋亡率明顯增加，腫瘤生長體積明顯受到抑制。

綜上，通過基因重組技術構建caspase-3 基因過表達慢病毒載體，體外轉染人LN-18 人神經膠質瘤細胞，可顯著促進LN-18 人神經膠質瘤細胞凋亡，明顯抑制腫瘤生長，具有良好的神經膠質瘤治療應用潛力。