右美托咪定對(duì)早期膿毒癥大鼠肺水通道蛋白基因表達(dá)及炎癥因子的影響

雷賢英 伍長學(xué)

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院ICU（四川瀘州646000）

膿毒癥是由細(xì)菌或內(nèi)毒素感染機(jī)體激活非特異性免疫反應(yīng)引起的一種嚴(yán)重疾病。右美托咪定（dexmedetomidine）作為具有代表性的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物之一，有研究表明其具有顯著的抗炎作用和肺保護(hù)作用［1］，但其具體肺保護(hù)機(jī)制仍不明確。本研究通過觀察右美托咪定對(duì)早期膿毒癥大鼠水通道蛋白（aquaporin，AQP）基因表達(dá)的影響，以探討右美托咪定在膿毒癥救治中的器官保護(hù)作用和機(jī)制，以尋找出治療膿毒癥的新方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康25月齡雄性Wistar大鼠40 只（西南醫(yī)科大學(xué)SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證：SYXK（川）2013-065），體質(zhì)量200～250 g。均飼養(yǎng)在SPF 級(jí)環(huán)境中，飼喂全價(jià)顆粒料，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)前禁食6 h，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制和藥物處理于2015年3-6月，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將40 只大鼠分為5 組（n = 8），分別為對(duì)照組（生理鹽水組）、膿毒癥模型組、右美托咪定低劑量治療組、右美托咪定中劑量治療組、右美托咪定高劑量治療組。采用清醒經(jīng)大鼠尾靜脈穿刺置留置針（22 號(hào)留置針）方法行尾靜脈保留置管，肝素水封管后絲線固定以備給藥。對(duì)照組以1 mL/kg 注射0.9% 生理鹽水，膿毒癥模型組以5 mg/kg 給予脂多糖復(fù)制膿毒癥大鼠模型（10 min 以上注射完），右美托咪定高/中/低治療組在5 mg/kg 注射LPS 建模成功后立即靜脈泵注負(fù)荷劑量右美托咪定（6.5 μg/kg，10 min 泵完），再分別按照4.5、1.5、0.5 μg/（kg·h）持續(xù)泵入右美托咪定6 h。

1.2.2 標(biāo)本采集6 h 后用1%戊巴比妥鈉靜脈緩慢注射麻醉處死大鼠，無菌條件下取下肺組織，將部分肺組織于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 熒光定量PCR 檢測(cè)AQP1 基因的表達(dá)取-80 ℃冷凍保存的大鼠肺組織，于研缽中剪碎后加入足量的液氮進(jìn)行快速研磨，轉(zhuǎn)移組織粉末至無RNA 酶的EP 管中，加入1 mL Trizol，吹打混勻，室溫放置5 min；加入0.2 mL 氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min，待自然分層；4 ℃，12 000 r/min 離心15 min，小心吸取上層水相于一新的1.5 mL EP 管中；加入0.5 mL 異丙醇，上下顛倒混勻，于室溫靜置10 min，于4 ℃下12 000 r/min 離心10 min，于管底部可見膠狀沉淀；棄上清，加入75%乙醇1 mL（用0.1% DEPC 配制），上下顛倒混懸洗滌RNA 沉淀；于4 ℃下7 500 r/min 離心6 min，棄去上清，再加入75%乙醇1 mL，重復(fù)1 次；超凈工作臺(tái)內(nèi)自然干燥5～10 min，待RNA 呈半透明狀態(tài)時(shí)，加30 μL 0.1% DEPC 水進(jìn)行充分溶解。取0.5 μg 總RNA 做模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制20 μL 反應(yīng)體系，42 ℃20 min，99 ℃5 min 進(jìn)行cDNA 合成反應(yīng)。取SYBR 2×Premix Ex TaqTMII，上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，cDNA 2 μL，在ABI7500熒光定量PCR 儀中以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)，讀板獲得融解曲線。得到每個(gè)樣品的Ct 值，以空白對(duì)照組為對(duì)照，以18sRNA 為內(nèi)參基因（表1），計(jì)算每個(gè)樣品的目的基因的相對(duì)表達(dá)量2-△△Ct，△△Ct =（待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct 值）-（對(duì)照組目的基因平均Ct 值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct 值），比率待測(cè)組/對(duì)照組=2-△△Ct。

表1 目的基因引物信息Tab.1 Information of target gene primer

1.3.2 肺組織干濕重（W/D）比值測(cè)定取部分肺組織，拭干表面血液后稱其質(zhì)量，即為濕質(zhì)量；采用真空干燥法，將稱重后的肺組織置真空干燥箱內(nèi)，70 ℃，真空4 mmHg 條件下烘烤22 h 后稱干重，計(jì)算W/D。

1.3.3 雙抗體ELISA 法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子取大鼠部分肺葉，制備10%的肺組織勻漿，于4 ℃下3 000 r/min離心15 min，迅速取其上清液，按照雙抗體夾心ELISA 法試劑盒說明書操作，測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同組間比較采用單因素方差分析。若組間存在顯著性差異，進(jìn)一步用Student-Newman-Keuls 法進(jìn)行兩兩比較，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP1、AQP5 基因表達(dá)比較與對(duì)照組比較，膿毒癥組AQP1、AQP5 基因表達(dá)量顯著降低；用中、低劑量右美托咪定干預(yù)處理后，AQP1、AQP5基因表達(dá)量出現(xiàn)一定程度的升高，但變化不明顯（P ＞0.05，表2），在高劑量藥物處理組，AQP1、AQP5 基因的表達(dá)與膿毒癥組比較，出現(xiàn)明顯增加（P ＜0.05，表2）。

表2 肺組織中AQP1、AQP5 表達(dá)變化Tab.2 Expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue ±s，μg/L

表2 肺組織中AQP1、AQP5 表達(dá)變化Tab.2 Expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue ±s，μg/L

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.001，△P ＜0.001；與膿毒癥組比較，#P ＜0.001，■P ＜0.001

分組對(duì)照組膿毒癥組低劑量組中劑量組高劑量組樣本量8 8 8 8 8 AQP1 1.072 6±0.491 6 0.119 7±0.034 4*0.253 7±0.012 0 0.295 3±0.004 7 0.966 1±0.171 2#AQP5 1.055 7±0.006 9 0.126 5±0.087 1△0.200 8±0.006 9 0.387 1±0.057 0 1.157 5±0.397 9■

2.2 各組肺W/D 比值比較與膿毒癥組比較，中、低劑量治療組W/D 值無明顯差異（P ＞0.05，表3），高治療劑量組W/D 值顯著降低（P ＜0.05，表3）。

表3 各組肺W/D 比值和肺組織病理學(xué)評(píng)分比較Tab.3 Comparison of lung W/D ratio and pathological score in lung tissue of each group ±s

表3 各組肺W/D 比值和肺組織病理學(xué)評(píng)分比較Tab.3 Comparison of lung W/D ratio and pathological score in lung tissue of each group ±s

注：與對(duì)照組比較，△P = 0.003，*P = 0.043；與膿毒癥組比較，#P=0.01

分組對(duì)照組膿毒癥組低劑量組中劑量組高劑量組樣本量8 8 8 8 8肺W/D 值4.66±0.51 5.72±0.52△5.28±0.49 5.30±0.43 4.82±0.54#肺組織病理學(xué)評(píng)分（分）3.26±1.10 6.61±1.75*5.30±1.87 5.26±1.96 5.04±2.01

2.3 肺組織病理學(xué)評(píng)分膿毒癥組肺組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于對(duì)照組（P ＜0.05）；各治療組的評(píng)分雖低于膿毒癥組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。見表3。

2.4 肺組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 濃度比較膿毒癥組肺組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 濃度在用脂多糖造模后表達(dá)升高；將高/中/低劑量各治療組與膿毒癥組進(jìn)行比較，各治療組TNF-α 的濃度均出現(xiàn)明顯降低（P ＜0.05），各治療組肺組織中IL-1β 的濃度變化不大（P ＞0.05），IL-6 的濃度在高劑量治療組降低明顯（P ＜0.05，表4）。

3 討論

右美托咪定是ICU、麻醉科常用的鎮(zhèn)靜劑之一，臨床應(yīng)用已比較廣泛，能夠有效緩解患者焦慮、譫妄、疼痛等癥狀，可以改善舒適度，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用，保證危重患者有創(chuàng)治療和操作的安全實(shí)施［2］，還常用于圍術(shù)期鎮(zhèn)靜及預(yù)防氣管插管反應(yīng)［3］。右美托咪定是一種新型高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑（α2AR），其內(nèi)在活性優(yōu)于可樂定，對(duì)患者意識(shí)程度影響較小，主要作用于腦干藍(lán)斑區(qū)的α2 受體，抑制交感神經(jīng)的活性，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等功效，同時(shí)還具有止涎、抗寒顫等作用，且能夠維持患者正常的免疫反應(yīng)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，α2 受體激動(dòng)劑能抑制外周單核巨噬細(xì)胞等的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生。α2 受體也廣泛分布于延髓、周圍血管及外周重要臟器等部位（包括肺、心臟、大腦等）。近年來，有學(xué)者對(duì)右美托咪定的臟器保護(hù)作用進(jìn)行了研究，其結(jié)果顯示對(duì)大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺等均具有一定的保護(hù)作用，但其具體機(jī)制目前還不太明確［4-5］。有臨床觀察［6］顯示，右美托咪定能減少老年患者術(shù)后譫妄的發(fā)生率，能降低譫妄測(cè)驗(yàn)（CAM-CR）評(píng)分。SHI 等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖引起的急性肺損傷動(dòng)物模型中，證實(shí)右美托咪定能減少肺組織中TLR4 mRNA表達(dá)，抑制肺組織的炎性反應(yīng)，并且降低肺組織重量-體重比，減輕肺水腫，減少胸膜滲出，從而起到肺保護(hù)的作用。對(duì)呼吸機(jī)所致肺損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，觀察到大劑量右美托咪定組血漿中的炎性因子明顯減少，肺組織水腫顯著減輕［8］。在脂多糖聯(lián)合IFN-γ刺激引起肺巨噬細(xì)胞活性損傷中，右美托咪定明顯降低了NR8383 細(xì)胞中iNOS 的表達(dá)量，該效應(yīng)可能是通過α2 腎上腺素受體進(jìn)行介導(dǎo)的［9］。CHIH 等［10］在觀察右美托咪定聯(lián)合氯胺酮應(yīng)用于內(nèi)毒素血癥大鼠機(jī)械通氣致肺損傷引發(fā)的肺部炎癥反應(yīng)中，觀察到二者聯(lián)用降低了BALF 小鼠總細(xì)胞數(shù)以及MIP-2、IL-β的濃度，同時(shí)降低了肺部W/D，能有效減輕肺部炎癥反應(yīng)。

表4 肺組織炎癥因子檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Results of inflammatory factor in lung tissue ±s，ng/L

表4 肺組織炎癥因子檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Results of inflammatory factor in lung tissue ±s，ng/L

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.001，*P=0.003；與膿毒癥組比較，bP=0.044，cP=0.035，dP=0.01，eP=0.02

分組對(duì)照組膿毒癥組低劑量組中劑量組高劑量組IL-6 4.036 0±1.645 5 7.986 6±2.447 1*6.082 3±2.108 8 5.363 7±0.200 0 4.162 6±0.090 5d樣本量8888 8 TNF-α 5.035 6±1.694 8 14.845 4±5.767 7a 9.392 7±0.768 7b 9.111 0±0.117 8c 8.396 0±2.565 1e IL-1β 5.531 4±1.739 2 7.656 8±3.289 6 5.209 7±0.218 7 2.836 0±0.144 9 4.981 3±0.727 3

急性肺損傷是膿毒癥時(shí)ARDS 的早期表現(xiàn)，臨床上以急性滲透性肺水腫和進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭為主要表現(xiàn)。肺水腫是其發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，隨著病情的發(fā)展，最終導(dǎo)致肺換氣功能障礙、肺內(nèi)分流增加，機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重缺氧、內(nèi)環(huán)境紊亂以及多器官損害。機(jī)體肺泡內(nèi)肺水的轉(zhuǎn)運(yùn)有兩種途徑：一是伴隨鈉離子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，二是經(jīng)過肺泡上皮內(nèi)的AQP 進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)［11］。AQP 是一組與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過水孔蛋白亞基的中心通道實(shí)現(xiàn)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在分子水平上經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)出入細(xì)胞膜的水量，在維持肺泡、肺間質(zhì)及肺毛細(xì)血管間的水平衡中起著重要的作用，尤其對(duì)清除肺泡內(nèi)多余液體起著主導(dǎo)作用［12］。整個(gè)肺組織以及呼吸道的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有AQP1 表達(dá)，AQP5 則表達(dá)在Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞和黏膜下的腺細(xì)胞內(nèi)。這些AQPs 在機(jī)體出生時(shí)會(huì)顯著增加，并受生長因子、激素、炎癥因子和滲透應(yīng)力的調(diào)節(jié)［13］。通過增加肺組織中AQP1 和AQP5 的表達(dá)可能會(huì)減輕急性肺損傷以及肺出血的發(fā)生［14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用脂多糖造模后的膿毒癥組AQP1、AQP5 基因的表達(dá)量顯著降低（P ＜0.05），與對(duì)照組比較，膿毒癥組肺組織W/D 比值和病理學(xué)評(píng)分比較明顯升高，肺組織TNF-α、IL-1β和IL-6濃度在用脂多糖造模后表達(dá)升高。這種現(xiàn)象在高巨等［15］關(guān)于“失血性休克-內(nèi)毒素”二次打擊大鼠肺組織水通道蛋白表達(dá)的研究中也得到證實(shí)，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)、腺病毒感染、高氧刺激等引發(fā)的肺損傷動(dòng)物模型中，均有AQP1 和AQP5 表達(dá)水平的下調(diào)，其表達(dá)水平與肺水腫和肺損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。可見，AQP1 和AQP5 在膿毒血癥相關(guān)的急性肺損傷中可能扮演更重要的角色。一系列的研究表明，炎癥因子在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中起著極其關(guān)鍵的作用，參與膿毒癥炎癥反應(yīng)的炎癥介質(zhì)主要為TNF-α、IL-1β和IL-6 等，由于炎性細(xì)胞因子大量釋放，誘導(dǎo)肺組織發(fā)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管通透性增加，肺泡內(nèi)液體的清除和轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙，中性粒細(xì)胞被激活，活性氧、蛋白酶等生物活性物質(zhì)以及TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎細(xì)胞因子得以釋放，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞間的緊密連接被破壞，肺泡毛細(xì)血管通透性增加。炎癥與水腫聯(lián)系密切，抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，控制炎性反應(yīng)，能夠增加AQP1 和AQP5 的表達(dá)及其提高其活性，進(jìn)而促進(jìn)肺泡內(nèi)液體的清除。腫瘤壞死因子等炎癥介質(zhì)能夠通過調(diào)控基因來改變水通道蛋白的合成速率，調(diào)節(jié)膜細(xì)胞膜上水通道蛋白的含量，使水通道蛋白表達(dá)下調(diào)［16］。

基于右美托咪定的抗炎和肺保護(hù)效應(yīng)，本研究觀察到，高劑量藥物處理組AQP1、AQP5 基因的表達(dá)與膿毒癥組比較，出現(xiàn)明顯增加（P ＜0.05）；用中、低劑量右美托咪定干預(yù)處理后，AQP1、AQP5基因表達(dá)量出現(xiàn)一定程度的表達(dá)升高，但變化不明顯（P ＞0.05）；高治療劑量組W/D 值明顯降低（P ＜0.05）；各治療組TNF-α 的濃度均出現(xiàn)明顯降低（P ＜0.05），但I(xiàn)L-1β 的濃度變化不大（P ＞0.05），IL-6 的濃度在高劑量治療組降低明顯（P ＜0.05）。高劑量的右美托咪定能抑制外周單核巨噬細(xì)胞等的激活，減少TNF-α、IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生，這些炎性因子的減少可改善毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及肺泡上皮細(xì)胞膜上水通道蛋白基因（AQP1、AQP5）的表達(dá)，肺泡內(nèi)液體清除加速。通過抑制炎性反應(yīng)增加水通道蛋白基因（AQP1、AQP5）的表達(dá)，減輕肺泡毛細(xì)血管的通透性，改善肺泡內(nèi)液體的清除速率可能是右美托咪定肺保護(hù)的機(jī)制所在。

綜上所述，高治療劑量［4.5 μg/（kg·h）］的右美托咪定能促進(jìn)早期膿毒癥大鼠AQP 基因的表達(dá)，降低肺組織W/D，減輕肺水腫，抑制炎癥因子的釋放，緩解肺損傷，具有肺保護(hù)的作用。