幽門螺桿菌感染者外周血CD4+T 細胞中Notch1 mRNA 的表達及其意義

謝金玲 溫俊杰 羅美群 胡冰心 吳丹琳 葉建斌 林彥青 寧云山 李妍

南方醫科大學檢驗與生物技術學院（廣州510515）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）定植于胃黏膜，引起胃部炎癥反應，若持續存在感染，可加重胃黏膜的炎癥反應，引發一系列的胃腸道疾病，甚至引起機體其他系統的病變［1-3］。在H.pylori 感染過程中，CD4+T 細胞主要分化成分泌IFN-γ 的Th1 細胞以抵御病原菌的感染［4］，特異性轉錄因子T-bet 基因是Th1 細胞分化的關鍵因子，促進IFN-γ因子的分泌［5］。近年來研究［6-8］表明，Notch1 在CD4+T 細胞向Th1 細胞極化過程中起重要調節作用并在一些感染性疾病中得到證實。因此，筆者推測Notch1 受體信號參與了H.pylori 感染誘導的CD4+T 細胞向Th1 細胞分化的過程。

H.pylori 感染率高，根除難，易復發，依然是全球的一大難題。因此，對H.pylori 感染后機體的免疫應答規律進行深入的研究并有效控制H.pylori的感染具有重大的社會和經濟意義。目前，國內外關于Notch1 在H.pylori 感染者中的表達尚無報道。本研究通過測定CD4+T 細胞中Notch1、T-bet的mRNA 表達及血漿中IFN-γ因子的含量，分析Notch1 在H.pylori 感染時是否參與Th1 細胞的分化相關，為深入探究Notch信號通路參與Th1細胞的抗H.pylori感染的作用機制提供實驗思路，未來或有望以Notch1 為靶點治療H.pylori 的感染，為臨床治療H.pylori感染提供新思路，有效控制H.pylori的感染。

1 資料與方法

1.1 一般資料入選標準：選取江門市新會區人民醫院2018年4～10月消化內科收治的在胃鏡下于胃竇鉗取組織作快速尿素酶試驗（試紙法），同時做14C 尿素呼氣試驗，兩者同時為陽性則判為H.pylori 陽性，兩者同時為陰性者判為H.pylori 陰性，其他情況排除出實驗。感染程度以14C 尿素呼氣試驗的dpm 值來判定。其中確認為H.pylori 感染的患者37 例，男26 例，女11 例，年齡23～86 歲，平均（58.95±2.153）歲。其中陰性的健康者35 例，男21 例，女14 例，年齡23～80 歲，平均（53.63 ±2.584）歲。排除標準：檢查前1～2周內曾服用過質子泵抑制劑（PPI）或抗生素的患者；患有其他嚴重慢性疾病的患者。本研究已通過江門市新會區人民醫院倫理委員會批準，所有研究對象已知情并簽署知情同意書。兩組別在性別、年齡等一般資料方面比較差異均無統計學意義。

1.2 主要材料及試劑Ficoll-Paque PLUS 淋巴分離液（Cat#71716700AG，GE Healthcare）；CD4+T 細胞分離試劑盒（Cat#MB17-R0034，MiltenyiBiotec）；RNAiso Plus 提取試劑（Cat#9109，Takara）；HiScript?ⅡQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）RT-PCR 逆轉錄試劑盒（Cat#R223-01，Vazyme）；ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）QPCR 熒光定量試劑盒（Cat#Q331-01，Vazyme）；Human Interferon γ（IFN-γ）ELISA Kit 定 量 試 劑 盒（Cat#CSBE04577h，CUSABIO Biotech）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理所有受試病例采靜脈肝素抗凝血5 mL。抗凝血先離心吸取上層血漿用于檢測血漿IFN-γ 因子含量，剩余血樣用等量生理鹽水稀釋，采用Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（peripheral bloodmononuclear cells，PBMC），分離出來的細胞再用美天旎磁珠分離出CD4+T 細胞，1 mL PBS 重懸，取20 μL 稀釋4 倍，上機計數單個核細胞，CD4+T 細胞占比均在90%以上，其余細胞離心后-80 ℃凍存至RNA 提取。

1.3.2 qRT-PCR 檢測Notch1 和T-bet 的mRNA 表達Trizol 法提取各樣本總RNA，以500 ng RNA 為模板，根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA 第1條鏈，反應條件：50 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。應用熒光定量試劑盒進行qRT-PCR 反應，按照以下組分配制real time-PCR 反應體系：10 μL 2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Low ROX Premixed），0.4 μL Forward primer（10 μmol/L），0.4 μL Reverse primer（10 μmol/L），1 μL cDNA，加ddH2O至20 μL 體系。反應條件：95 ℃預變性30 s，在95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環，最后在95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s 形成熔解曲線。測試時均做3 個復孔，所測基因均用β-actin 作內參，用2-△△CT方法計算目的基因相對表達量。人Notch1 受體和β-actin 引物由本實驗室前期研究設計，T-bet 轉錄因子的引物參考Nogueira 文獻報道［9］，以上引物在廣州艾基生物公司進行合成。詳細引物序列見表1。

表1 Notch1、T-bet、β-actin 的qRT-PCR 引物Tab.1 Sequence of primers

1.3.3 ELISA法定量檢測血漿IFN-γ因子ELISA法定量檢測血漿IFN-γ 因子，嚴格按說明書進行操作，設8 個標準品，濃度值分別為0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 pg/mL，測定波長為450 nm，均設3 個復孔，根據各個標準品所測OD 均值，利用CurveExpert1.4 軟件進行標準曲線擬合，并以樣本OD 均值計算出樣本濃度。

1.4 統計學方法采用GraphPad Prism 6.0 統計軟件進行分析。各項計量指標以（± s）表示，樣本差異檢驗采用獨立樣本t 檢驗，相關性采用Pearson相關分析，P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H.pylori 感染者CD4+T 細胞中Notch1 mRNA表達高于健康者為了比較H.Pylori 感染者與健康體檢者CD4+T 細胞中Notch1 mRNA 的表達水平差異，利用qPCR 進行檢測。見圖1，與對照組中Notch1 mRNA 的表達水平（1.107±0.066 8，n=35）相比較，H.Pylori 感染組中Notch1mRNA 的表達水平（3.154 ± 0.423 6，n = 37）明顯升高，差異具有統計學意義（P ＜0.000 1）。

圖1 Notch1 在正常人及H.pylori 感染者CD4+T 細胞中mRNA 的表達水平Fig.1 The expression of Notch1 mRNA in CD4+T cell of Normal subjects and H.pylori-infected patients

2.2 H.pylori 感染者CD4+ T 細胞中T-bet mRNA的表達高于健康者為了比較H.Pylori 感染者與健康體檢者CD4+T 細胞中T-bet mRNA 的表達水平差異，利用Q-PCR進行檢測。見圖2，與對照組中T-bet mRNA 的表達水平（1.178 ± 0.101 7，n = 35）相比較，H.Pylori 感染組中T-bet mRNA 的表達水平（1.793 ± 0.244 6，n = 37）升高，差異具有統計學意義（P ＜0.05）。

圖2 T-bet 在正常人及H.pylori 感染者CD4+T 細胞中mRNA 的表達水平Fig.2 The expression of T-bet mRNA in CD4+T cell of Normal subjects and H.pylori-infected patients

2.3 H.pylori 感染者血漿中IFN-因子含量高于健康者為了比較H.Pylori 感染者與健康體檢者血漿中IFN-γ因子的含量水平差異，利用ELISA 法進行定量檢測。見表2，與對照組中IFN-γ因子的含量水平［（222.8 ± 45.56）pg/mL，n = 35］相比較，H.Pylori 感染組中IFN-γ 因子的含量水平［（986.7 ± 187.3）pg/mL，n = 37］明顯升高，差異具有統計學意義（P ＜0.05）。

表2 血漿IFN-γ 因子在正常人及H.pylori 感染者中的含量水平Tab.2 The concentration of the IFN-γ in blood plasma of Normal subjects and H.pylori-infected patients ±s

表2 血漿IFN-γ 因子在正常人及H.pylori 感染者中的含量水平Tab.2 The concentration of the IFN-γ in blood plasma of Normal subjects and H.pylori-infected patients ±s

對照組H.pylori 感染組例數35 37 IFN-γ濃度（pg/mL）222.8±45.56 986.7±187.3 P 值＜0.05

2.4 H.pylori 感染組中T-bet mRNA 的表達與Notch1 mRNA 的表達呈正相關以上實驗表明，H.pylori感染者CD4+T細胞中Notch1 mRNA和T-bet mRNA 表達都高于對照組，為了進一步評估T-bet的表達與Notch1 的表達是否相關，利用Pearson 相關分析對它們的表達進行評估。見圖3，H.pylori感染組中T-bet mRNA 的表達水平與Notch1 mRNA表達水平呈正相關（r=0.558 6，P ＜0.000 1）。

圖3 H.pylori 感染者CD4+T 細胞中T-bet 與Notch1 mRNA表達水平的相關性Fig.3 The correlation between the expression of T-bet and Notch1 mRNA in CD4+T cell of H.pylori-infected patients

2.5 H.pylori 感染組中血漿IFN-γ 因子含量與Notch1 mRNA 的表達水平的相關性以上實驗表明，H.pylori 感染者中Notch1 mRNA 和IFN-γ因子的表達都高于對照組，為了進一步評估IFN-γ因子的含量與Notch1 mRNA 的表達是否相關，利用Pearson 相關分析對它們的表達進行評估。結果顯示IFN-γ因子的分泌與Notch1 的表達沒有相關性（P ＞0.05）。

3 討論

已有的研究表明，細胞因子環境在CD4+T 細胞分化過程中決定著分化的方向［10-11］，但細胞因子作用模式并不能完全詮釋病原體誘導CD4+T 細胞分化的機制，其他信號分子也參與調控CD4+T細胞的分化進程。因此，探索參與H.pylori 感染誘導CD4+T 細胞分化的信號傳導通路，有助于理解抗H.pylori 感染的宿主防御機制及CD4+T 細胞的分化過程。

Notch 信號通路是一種高度保守的信號傳導路徑，廣泛存在于細胞表面，在細胞的發育過程中決定細胞不同的分化方向，維持細胞的增殖、分化和凋亡的平衡。哺乳動物有4 種Notch 受體（Notch1-4）和5 種Notch 配體（Delta-like1，3，4，Jagged1和Jagged2）。Notch受體與配體結合后，胞內段在近膜處經γ-分泌酶（γ-secretase）的水解，Notch 受體胞內區（Notch intracellular domain，NICD）脫離，NICD 是Notch 受體的活化形式，其進入細胞核與核結合蛋白CSL（CBF1 suppressor of hairless-Lag1，CSL）結合，激活相關轉錄因子的表達。

已有研究［12］表明，Notch 信號通路在多種免疫細胞的分化中起重要作用，如參與CD4+T 細胞亞群的分化［13-14］，決定CD4+T 細胞的存活［15］，維持記憶性CD4+T 細胞的功能［15］，阻止CD4+T 細胞的凋亡［16］，初始CD4+T 細胞的表面可以檢測到低水平的Notch1 和Notch2 的表達，經T 細胞受體（T cell receptor TCR）活化后CD4+T 細胞表面表達Notch信號通路的所有受體［17］。綜上所述，Notch 信號通路參與CD4+T 細胞分化過程并發揮重要的調控作用。

近年來研究表明，Notch1 在CD4+T 細胞向Th1細胞極化過程中起重要調節作用［18］。Notch1 和Notch2 基因缺陷的小鼠不能分泌INF-γ，從而不能抵抗利士曼原蟲的感染［19］。再生障礙性貧血患者的外周血單核細胞中NICD1（Notch1 的活化形式）與TBX21（T-bet 的編碼基因）的啟動子結合，調節Th1 介導的免疫反應［20］。新型隱球菌在肺部的感染過程中，Notch 信號缺失的情況下，INF-γ的分泌減少，保護性Th1 型反應明顯受損［7］。在體內外CD4+T 細胞分化過程中加入GSI（γ-secretase 分泌酶抑制劑，抑制Notch 信號通路）后，轉錄因子T-bet 的表達降低，INF-γ的分泌減少，從而抑制Th1 細胞的分化［21-22］。阻斷Notch1 信號通路可增強慢性乙型肝炎患者Th1 細胞免疫反應，這可能與慢性乙肝患者機體的免疫耐受相關［23］。可見，Notch 信號通路參與CD4+T 細胞分化成Th1 細胞。有研究表明以Notch 信號通路為靶標，可以有效防治一些炎性疾病。如用GSI 可以減輕Th1 介導的多發性硬化模型-小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、膠原誘導性關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）和再生障礙性貧血的癥狀［21-22，24］。綜上所述，Notch 信號通路參與了Th1 細胞的分化并為一些炎癥性疾病的治療提供新思路。H.pylori 感染引起宿主CD4+T 細胞主要分化成分泌IFN-γ的Th1 細胞，抵御病原菌的感染［25］，但關于Notch 信號是否參與調控H.pylori 感染引起的Th1 細胞的分化，目前尚未見文獻報道，因此探討這方面的研究必將加深人們對H.pylori 感染的認知。

在本研究中，H.pylori 感染者CD4+T 細胞中Notch1 mRNA 的表達量明顯比未感染者升高，差異有統計學意義，說明Notch1 在機體對抗H.pylori感染中發揮一定的作用。另外，H.pylori 感染組中T-bet mRNA 的表達水平高于健康對照組，差異具有統計學意義，這一結果表明，在H.pylori 感染后，機體存在著Th1 細胞分化的加強。隨后發現，H.pylori 感染者血漿中IFN-γ的表達高于未感染者，差異有統計學意義，這一結果更加證實了H.pylori 的感染誘導Th1 細胞的分化。這結果與WEN 等［26］報道的肝纖維化的組織學分期與肝內T-bet+Th1 細胞數量呈正相關（r = 0.685）相似，肝內Th1 細胞與肝纖維化進程有關，提示著T-bet+Th1細胞與抗H.pylori的感染有關。同時，對H.pylori感染者T-bet 與Notch1 的表達進行了相關性分析，結果顯示H.pylori 感染組中T-bet mRNA 表達水平與Notch1 mRNA 表達水平呈正相關（r = 0.558 6，P ＜0.000 1），提示著Notch1 參與了CD4+T 細胞向Th1 細胞的分化，從而促進了Th1 細胞抗H.pylori的感染。雖然H.pylori 感染者CD4+T 細胞中IFN-γ的表達高于未感染者，但血漿IFN-γ因子含量與Notch1 mRNA 的表達水平無相關性，這提示著血漿中IFN-γ因子的分泌，并非完全依賴于Notch1信號通路，還有其他的信號路徑參與了IFN-γ因子的分泌，抵御機體抗H.pylori 感染。這結果與AUDERSET 等［19］的研究結果接近，缺乏Notch1 基因的耐利士曼原蟲感染的小鼠，感染利什曼原蟲后同樣可引起高IFN-γ水平的保護性Th1 反應，證明Notch1 并不是Th1 分化過程的唯一關鍵因素。

綜上所述，Notch1 在H.pylori 感染時升高，Tbet 的表達也升高，且兩者呈正相關關系，說明Notch1 信號通路在抗H.pylori 感染中參與了CD4+T細胞向Th1 細胞的分化過程，發揮了一定的作用，但其并非為分泌IFN-γ因子抵御H.pylori 感染的唯一信號傳導通路。因此，探索與分泌IFN-γ因子密切相關的路徑，及其與H.pylori 感染的不同炎癥程度，及其與胃癌發展的相關機制等問題仍需要進行深入地研究，以達到有效防治H.pylori感染。