不同心血管危險分層高血壓患者腸道菌群多樣性分析

陳維玉 陳揚平， 馮婷 胡興衛 周風云路祥麒 張秋霞 張新祿 陳鵬 修建成

南方醫科大學南方醫院1心血管內科，2科研處（廣州510515）；3南方醫科大學基礎醫學院病生教研室（廣州510515）

高血壓是最常見的慢性非傳染性疾病，也是心腦血管疾病最主要的危險因素之一［1］。據世界衛生組織統計，全球范圍內高血壓患者超過10 億。而且，隨著人口老齡化的發展，預計到2025年全球高血壓患病人數將上升至15 億［2］。高血壓是多因素共同作用、相互疊加的結果，尤其是遺傳因素和環境因素［3-4］，其發病機制尚未明確。近年來，腸道微生物改變宿主健康狀況的潛在作用引起了國內外研究人員的關注。越來越多的證據表明腸道微生態失調與高血壓密切相關［5］，16S rDNA 高通量測序技術分析發現高血壓動物和高血壓人群均存在腸道微生態的失調［6］。LI 等［7］對高血壓前期及高血壓患者進行了宏基因組測序，并將高血壓患者糞便移植到無菌小鼠體內，其結果證實了異常腸道微生物在高血壓發病機制中的作用，并強調了早期干預對高血壓前期的意義。有趣的是，高血壓的分級與患者富集的基因關聯群組（metagenomic linkage groups，MLG）的豐度呈正相關，而與健康組富集的MLG 豐度呈負相關，表明微生物相對豐度可能是高血壓發展的潛在風險因素［8］。

高血壓是一種多病因相互作用導致的復雜性進行性心血管綜合征，血壓數值只是高血壓的一項生物指標，并不能決定其預后。臨床實踐中將高血壓人群的心血管風險分為低危、中危、高危和很高危。研究證實，心血管危險分層對各種心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）事件發生（心肌梗死、心血管死亡率、總死亡率及主要心血管事件）具有非常好的預測價值［9］。因此，本研究擬探索不同心血管危險分層高血壓患者腸道菌群組成及豐度的變化，以進一步揭示高血壓疾病進展的相關機制，為降低高血壓心血管事件的發生風險提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究共入組85 例原發性高血壓患者，根據2018 歐洲高血壓指南［10］將患者分為高血壓低中危組（LI 組）、高危組（H 組）及很高危組（VH組），所有個體均來自南方醫科大學南方醫院心血管內科。排除標準：（1）患者＜18 歲；（2）患有腫瘤、心力衰竭、心肌梗死、呼吸道感染等疾病；（3）2 個月內接受過抗生素或益生菌治療。該研究通過了南方醫科大學南方醫院倫理委員會關于開展臨床研究的審批，充分告知入組病人并獲簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 患者資料收集患者的資料分為基本資料和臨床資料。基本資料包括：姓名、性別、年齡、身高、體質量、BMI、吸煙、心功能、既往病史（高血壓、冠心病、糖尿病、慢性肺病、心外動脈疾病等）。臨床檢查資料包括：患者血壓、生化及檢查指標。患者的血壓以患者入院時測量的肱動脈壓為準，測量方法符合《中國血壓測量指南》的標準。生化指標通過患者入院抽血檢查中獲得，包括血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血清肌酐等；檢查指標包括：心臟射血分數、肺動脈壓等。

1.2.2 患者心血管危險因素分層根據2018年歐洲高血壓指南［10］，將患者分為高血壓低中危組、高危組、很高危組3 組。其中，Score 評分是評估高血壓患者10年心血管事件發生風險的重要指標，使用在線網站（http：//www.euroscore.org/calc.html）計算各患者Score 評分，按照2018 歐洲高血壓指南將Score 評分≥10%，或重度慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）、伴有靶器官損害的糖尿病、達到50%以上的血管狹窄、或發生臨床心血管疾病（包括ACS、卒中等）評為很高危；Score 評分5% ～10%，或單個危險因素（尤其是膽固醇）顯著升高、3 級高血壓、無靶器官損害的糖尿病患者、高血壓伴左室肥厚、中度CKD 為高危；Score 評分1% ～5%，或2 級高血壓為中危；10年Score 評分＜1%為低危。

1.2.3 樣品采集和DNA 提取收集患者的新鮮糞便樣本，20 min 內置于液氮罐中運送至實驗室于-80 ℃保存。稱取糞便樣品20～50 mg，加PBS和0.5% Tween-20 混 勻 進 行-80 ℃10 min 和60 ℃5 min 反復凍融3 次，用蛋白酶K、RNA 裂解酶和10% SDS 于55 ℃金屬浴中裂解糞便樣品，離心取上清，加入酚、氯仿、NaoAC 和異丙醇抽提菌液DNA，并用75% 乙醇洗滌沉淀，最后將DNA 樣品溶解于雙蒸水中。采用Qubit 對DNA 濃度進行定量，并通過Agilent 2100 評價DNA 完整性，將DNA質量合格的樣本用于文庫構建。

1.2.4 文庫構建采用二步PCR 方法構建樣本文庫，以不同樣本DNA為模板，通過PCR反應完成第一輪擴增，采用磁珠法純化PCR 產物，然后用含有不同index 的引物進行第二輪PCR 擴增，再經磁珠純化后，應用Qubit 和Agilent 2100 檢測文庫質量。最后采用Illumina Hiseq測序平臺對樣品進行測序。

1.2.5 16S rDNA 高通量測序采用Illumina HiSeq 測序儀進行高通量測序。文庫制備完成后，簇生成和測序都在HiSeq 上完成。對提取的DNA 樣本進行16S rDNA V3V4 區基因擴增及測序，擴增引物為5′-GTGTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-CCGGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′。對各樣品進行PCR 擴增和總體測序分析。

1.2.6 數據分析測序得到的原始數據經過質量控制測序接頭序列、低質量序列和低復雜度序列，利用重疊關系進行序列拼接。應用Usearch 10.0軟件在97%相似度下聚類得到操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）并去除嵌合體序列。基于Greengene 數據庫對OTU 代表序列進行比對和物種注釋。基于每個注釋物種得到的reads 豐度，利用Kruskal-Wallis 方法計算3 組患者物種注釋上的豐度差異情況。使用Qiime 1.9.0 軟件基于OTU 的分析結果，抽取一組N 條reads（N 小于reads 總數M），進行樣品微生物α多樣性分析，通過α 多樣性分析能夠了解樣品中微生物多樣性程度，多樣性指數包含Observes species、Shannon 指數等，并根據分析結果做出稀釋曲線。使用Qiime 1.9.0 軟件，匯總不同樣本中屬于相同物種的reads數據，計算樣本間距離矩陣，得到的矩陣用于PCoA 可視化進行樣品微生物β多樣性分析。

1.3 統計學方法用R 3.5.2 軟件進行統計分析。計量資料呈正態分布且使用均數±標準差來表示，其他使用中位數（四分位數）表示，計數資料用率來表示。使用One way ANOVA 進行兩組以上正態分布資料的檢驗，其他使用kruskal-wallis H 檢驗統計計量資料；計數資料比較用R×C 格表χ2檢驗或校正χ2檢驗或確切概率檢驗。spearman 相關分析用來評價腸道菌群與Score 評分相關性。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高血壓不同危險分層患者腸道微生物的組成和多樣性分析本項目共入組85 例原發性高血壓患者，根據2018 歐洲高血壓指南進一步分為高血壓低中危組、高危組和很高危組。3 組患者的人口學及臨床資料特征見表1。結果顯示，除血壓、年齡、血清肌酐和臨床并發癥外其余指標的組間比較差異無統計學意義（P＜0.05）。

為研究不同心血管危險分層高血壓患者的腸道菌群組成，本項目對糞便樣品進行了16S rDNA高通量測序，獲得了3 860 470 條高質量序列（平均每個樣品45 417 條）。α多樣性分析結果發現隨著高血壓危險分層的升高，患者腸道微生物的Shannon和Observed_species指數均顯示出降低的趨勢（圖1A、B），但差異無統計學意義（P ＞0.05）。加權的主坐標分析（weighted principal coordinate analysis，WPCoA）結果表明：3 組患者之間的腸道菌群差異有統計學意義（P＜0.05，圖1C）。

表1 研究人群的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of the study cohort M（Q1，Q3）

2.2 高血壓不同危險分層患者腸道菌群顯著性差異分析基于Qiime 1.9.0軟件分析得出的腸道菌群相對豐度，進一步應用R3.5.2 軟件分析組間物種屬水平的差異。結果顯示高血壓低中危組、高危組和很高危組的腸道菌群的組成存在顯著差異，羅斯氏菌屬（VH vs. LI，P＜0.001；H vs. LI，P＜0.01）和Anaerostipes 菌屬（VH vs. LI，P＜0.01；H vs. LI，P＜0.01）在很高危組和高危組中的豐度相對低中危組顯著降低，而很高危組放線菌屬（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.01）、瘤胃球菌屬（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.05）、毛螺旋菌屬（VH vs.H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.01）、嗜膽菌屬（VH vs.H，P＜0.001；VH vs. LI，P＜0.05）和SMB53 菌屬（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.05）的相對豐度顯著低于高危組和低中危組（圖2）。

圖1 3 組患者之間腸道微生物多樣性分析Fig.1 Analysis of gut microbiota diversity between three groups of patients

圖2 3 組患者之間存在顯著差異的菌屬Fig.2 Significant differences between the three groups of bacteria

2.3 腸道菌群與Score 評分相關性分析為了探究腸道菌群與高血壓患者發生心血管事件風險的關聯，本研究統計了入組患者的年齡、性別、血清肌酐、心臟射血分數、肺動脈壓、既往病史（如心臟疾病、糖尿病、慢性肺病、心臟外動脈疾病等）等臨床指標，根據EuroScoreⅡ3 系統進一步計算出患者的Score 評分，并就其與腸道微生物作Spearman 相關性分析，結果顯示，克雷伯氏菌屬（r = 0.238，P＜0.05）和顫螺旋菌屬（r=0.243，P＜0.05）的豐度與Score 評分呈正相關，而毛螺旋菌屬（r=-0.491，P＜0.001）和羅斯氏菌屬（r =-0.385，P＜0.01）的豐度與Score 評分呈負相關（圖3）。

3 討論

既往多項研究［6，11］表明，高血壓患者存在明顯的腸道菌群紊亂及腸黏膜屏障功能失調，而且，腸道菌群在阻塞性呼吸睡眠暫停大鼠誘導高血壓過程中發揮關鍵作用［12］，以上顯示腸道菌群在高血壓發生過程中的重要地位，提示腸道菌群檢測具有疾病診斷和風險評估的潛在價值，同時有可能成為高血壓新的干預靶點。本研究通過分析不同心血管危險分層高血壓患者腸道菌群的差異，探索高血壓危險分層相關的疾病特征菌，為基于機器學習的心血管事件風險評估模型提供理論依據。研究結果顯示不同危險分層的高血壓患者，其腸道菌群的α多樣性差異無統計學意義，菌群相對豐度存在顯著差異。

圖3 Score 評分與菌屬之間Spearman 相關性分析Fig.3 Spearman correlation analysis between the Score value and bacteria

在屬的水平，很高危組及高危組患者的羅斯氏菌和Anaerostipes 菌的相對豐度較低中危組的患者顯著降低，而放線菌、瘤胃球菌、毛螺旋菌、嗜膽菌和SMB53 在很高危組患者中的相對豐度顯著低于高危組及低中危組患者（P＜0.05）。據報道，羅斯氏菌和Anaerostipes 為丁酸產生菌［13］，丁酸鹽可以通過上調腸上皮緊密連接蛋白的表達來維持腸粘膜完整性，進而阻止脂多糖、三甲胺等有害產物進入血液［14］。毛螺旋菌為丙酸產生菌［13］，瘤胃球菌的主要發酵產物為乙酸［15］，而乙酸、丙酸和丁酸均屬于短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），是腸道微生物發酵膳食纖維產生的代謝物。既往研究發現，SCFAs 可以通過嗅覺感受器受體（olfactory receptor78，Olfr78）和G 蛋白偶聯受體41（G protein-coupled receptor 41，Gpr41）調控血壓，從而維持血壓的穩態［16］。MARQUES 等［17］也證實了高纖維飲食和補充乙酸酯均可以明顯降低鹽皮質激素誘導的小鼠血壓水平、減少心肌纖維化和左心室肥厚，其機制是通過調節心臟和腎臟Egr1、腎臟RAAS 和心臟MAPK 的表達來發揮作用的。本研究也發現產生SCFAs 的羅斯氏菌、Anaerostipes、毛螺旋菌和瘤胃球菌的豐度隨著高血壓心血管危險程度的增加而顯著降低，提示SCFAs 有可能成為評估心血管事件的新的風險預測因子，但仍需進一步研究證實。

此外，本研究通過Spearman 相關系數分析發現羅斯氏菌屬和毛螺旋菌屬豐度與Score 評分呈負相關，而克雷伯氏菌屬和顫螺旋菌屬豐度與Score 評分呈正相關（P＜0.05）。既短鏈脂肪酸產生菌羅斯氏菌和毛螺旋菌的豐度與高血壓10年心血管事件發生風險呈負相關。因此，本研究推測這兩種菌可能是降低心血管危險的有益菌。最近發表在Nature Microbiology 的一項研究表明，通過給ApoE-/-無菌小鼠定殖不同產丁酸能力的特定菌群，發現在富含植物多糖的飲食作用下，腸道羅斯氏菌可調節結腸表觀遺傳，使腸細胞從糖酵解向利用脂肪酸轉變，降低內毒素和炎癥反應，延緩動脈粥樣硬化的發展［18］。這與本研究結果是互為補充的。克雷伯氏菌和顫螺旋菌與高血壓10年心血管事件發生風險呈正相關。已有研究［7］報道，在高血壓前期和高血壓人群中普氏菌和克雷伯氏菌以及與疾病相關的微生物過度生長。并且，克雷伯氏菌可以通過脂多糖激發的免疫應激導致炎癥反應［19］。這提示，通過微生態制劑調節調整腸道微生態的平衡可能有助于腸道正常菌群的恢復，從而預防心血管事件的發生，但仍需更有力的實驗數據支持。

本研究存在一定的局限性。首先，入選人群均來自南方醫科大學南方醫院門診和住院病人，具有明顯的地域局限性。其次，由于對本研究的納入及排除標準進行了嚴格控制，導致入組的人數有限，這對研究結果的普遍性也具有一定的影響，還需更大樣本研究加以證實。另外，腸道菌群及其代謝產物（如SCFAs）和高血壓心血管危險分層之間的因果關系也需要動物實驗進一步驗證。

綜上所述，本研究對不同心血管危險分層高血壓患者腸道菌群的組成及多樣性做了初步探索，證實高血壓發生心血管事件的風險與腸道菌群之間存在一定的關系。通過構建相關模型，腸道菌群有望成為一項新的預測和監控高血壓發生心血管事件風險的臨床指標。